强心安神方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的保护作用,及机制探讨*

卿媛媛，李茹，王芳婷，陶源，张婷，庄红，颜旭

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南省中医药研究院附属医院 湖南长沙 410006

心力衰竭（ChronicHeartFailure，CHF）是心血管疾病进展至末期的病理表现。我国目前的心衰患者高达 890 万，而且有30%～35%的住院病人同时伴有CHF，心衰的再住院率占心血管事件的16.7%，虽然目前心衰患者死亡率呈明显下降趋势，但再住院率仍在增加[1-2]。因此改善心衰患者的预后及降低再住院率是极期重要的临床工作。课题组前期实验研究发现强心安神方可抑制神经内分泌因子及肾素-血管紧张素系统过度激活、改善心肌细胞线粒体呼吸功能与COX活性，改善心肌细胞能量代谢有关，可能存在其他作用机制[3-6]。本实验以强心安神方对心衰大鼠进行干预治疗，观察大鼠心脏彩超左室射血分数（LVEF）值、左室收缩率（LVFS）值及心肌细胞凋亡情况，观察心肌细胞凋亡标志性蛋白CHOPmRNA、GRP78mRNA表达的差异，探索其治疗心力衰竭的作用机制。

1 实验动物

湖南中医药大学动物中心Wistar雄性大鼠共60只，平均体质量约200g左右。

2 主要仪器与试剂

荧光PCR仪（型号：CFX Connect™实时，厂家：伯乐生命医学产品（上海）有限公司）小动物超声影像（型号：Vevo2100，厂家：VisualSonics）微型离心机（型号：D1008E，SCJLOGEX）；
旋涡混合器（型号：XH-C，厂家：常州越新仪器制造有限公司）等。盐酸阿霉素购于深圳万乐药业有限公司（生产批号：1812E1）；
卡托普利购于华中药业股份有限公司（生产批号：20161101）；
湖南春光九汇有限公司提供强心安神方超微颗粒（炙黄芪 10g，酸枣仁15g，黄连3g，肉桂2g，阿胶6g，五加皮10g，制首乌10g，葶苈子5g，三七3g）；
UltraSYBR Mixture出自CWBIO 康为世纪（生产批号：CW0957M）；
苏木素染液（生产批号：ZLI-9610，品牌：中衫金桥）；
伊红染色液出自Solarbio品牌（生产批号：G1100）；
Scott蓝化液出自Solarbio品牌（生产批号：G1865）。

3 实验方法

3.1 模型制备 参照文献[7]报道采用盐酸阿霉素（ADR）腹腔注射进行造模，第1～3周按照3mg/kg 剂量对大鼠进行腹腔注射，第4～6周则按2mg/kg剂量进行腹腔注射，1次/周；
按1周1次的频率给药，每天观察大鼠的精神状态及行为学改变情况，给药连续6周后，根据大鼠心脏超声结果以及NT-proBNP水平，以判断造模是否成功。

3.2 实验分组及给药 将60只Wister大鼠分为正常对照组9只，造模组51只，从造模成功后的大鼠中随机抽取36只并随机分为CHF 模型组（等量灭菌蒸馏水，Model）、卡托普利组（2.7mg/kg，Captopril）、强心安神方小剂量组（0.16g/kg，Small dose）、强心安神方大剂量组（0.64g/kg，Large dose），每组大鼠各9只。各组括号内药物剂量按照人体与动物等效剂量系数换算得出，每组按照每天一次的频率灌胃给药，4周后可观察一般情况，用于后期心脏彩超、心肌细胞凋亡情况及内质网应激特异性蛋白GRP78、CHOP的检测。

4 观察指标

4.1 心肌细胞凋亡检测（TUNEL 法） 取大鼠左心室游离壁中间的心室肌肉，浸入 4%多聚甲醛溶液中，固定 24 h后，经过各级乙醇溶液进行脱水处理，放入石蜡和二甲苯按照1：1配制的混合液中15min，再依次放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡50min左右，予以石蜡包埋继而切片后进行烤片，然后进行脱蜡、水化处理后，放入苏木精水溶液中染色3min，盐酸乙醇分化液分化15s，稍行水洗后，返蓝液返蓝15s，流水冲洗5min，再置入伊红染色3min，继续用流水冲洗5min，再次进行脱水、透明、封片后镜下检测观察病理情况。

4.2 心脏功能检测 应用小动物超声影像测量大鼠左室射血分数（LVEF）及左室收缩率（LVFS）。

4.3 内质网应激标志性基因GRP78、CHOP mRNA检测 在湿度55%，温度21℃的实验室内，采用Real Time-PCR法，TRIZOL 法提取总RNA，按Fermetas 公司逆转录试剂盒操作逆转录为cDNA，后进行PCR 扩增，退火温度分别为：58.2℃、58.6℃、56.5℃，用1.5% 琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统进行拍照并对DNA目条带扫描处理，基于GAPDH内参分析各基因与之相对应的表达水平。见表1。

表1 引物信息表

5 统计学方法

使用SPSS26.0软件进行数据处理及统计分析，计量资料均采用（±s）表示。多组间数据分析采用单因素方差分析，两组间比较采用最小显著差数（LSD）法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

1 心肌组织病理学

正常组心肌排列有序，组织有轻微肿胀充血，模型组心肌排列紊乱，肌浆呈凝固性坏死或空泡，细胞核固缩甚至破裂，与模型组比较强心安神方小剂量组、强心安神方大剂量组、卡托普利组心肌排列整齐致密，其中强心安神方大剂量组、卡托普利组效果更好。见图1。

图1 心肌组织HE染色结果（HE×400）

2 心功能超声检测

与正常对照组相比，模型组、强心安神方小剂量组、强心安神方大剂量组及卡托普利组的EF、FS均显著降低，P＜0.01，差异有统计学意义。见表2。

表2 各组大鼠彩超结果比较

3 RT-PCR检测GRP78 mRNA、CHOP mRNA比较

与正常对照组相比，模型组、强心安神方小剂量组、 强心安神方大剂量组、卡托普利组GRP78 mRNA表达均升高（P＜0.05）；
与模型组相比，强心安神方大剂量组GRP78 mRNA表达降低（P＜0.05）；
与正常对照组相比，模型组、强心安神方小剂量组、 强心安神方大剂量组、卡托普利组CHOPmRNA表达升高（P＞0.05）；
与模型组、对照组相比，卡托普利CHOPmRNA表达升高（P＜0.05）。见图2。

图2 各组RT-PCR检测GRP78 mRNA、CHOP mRNA

“慢性心力衰竭”可归属于中国古代医学的“喘证”“水肿”“胸痹”等范畴，其主要病机可概括为“虚”“瘀”“水”，病位在心，与它脏均密切相关，病理产物主要为“瘀血”“痰浊”“水饮”，临床上以“益气养阴温阳”法治其本，“活血利水”法治其标可取得良好疗效[8]。“强心安神方”以炙黄芪为君药，取其补气升阳、利水消肿、行滞通痹之功效，方中制首乌补肝肾、益精血，二药合用益气养阴温阳，使阴阳相交，共奏强心安神之效；
取三七活血消肿、大黄逐瘀利湿通腑之效，葶苈子善入肺经而平喘并利胸胁之水协同五加皮利水消肿，共为臣药以化瘀利水；
黄连、肉桂配伍以交通心肾，阿胶养血生津，加之酸枣仁四药可除烦热、安心神。以上药物组成可益气养阴温阳，强心安神。

心力衰竭的不断进展以心室重构为生理病理基础，而心肌细胞的过度凋亡是心室重构的典型表现，其贯穿于心衰发生发展的始终。细胞凋亡是在内在基因调控下的细胞自主的有序死亡，心肌细胞的过度凋亡可以引起心脏收缩单位的减少进一步导致心室重构[9]。本研究采用盐酸阿霉素腹腔注射诱导心肌细胞凋亡的心力衰竭大鼠模型，结果显示，正常对照组组织有轻微肿胀充血，心肌排列整齐；
模型组心肌细胞凋亡最明显；
与模型组比较强心安神方小剂量组、强心安神方大剂量组、卡托普利组心肌细胞坏死程度明显减轻，这表明强心安神方以及卡托普利对于心肌细胞具有保护作用，可抑制心肌细胞的凋亡。相比于对照组，模型组、强心安神方小剂量组、强心安神方大剂量组、卡托普利组的LVEF、LVFS均显著降低，P＜0.01，虽然强心安神方小剂量组、大剂量组以及卡托普利组大鼠LVEF以及LVFS相比较模型组有所提高，但差异不明显，不具有统计学意义。结合前期研究成果及文献考虑可能阿霉素造模大鼠心脏毒性大，经6周造模后，大鼠心脏结构改变，而本实验仅用药物干预4周，药效还不足以使心脏结构恢复。

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）作为细胞凋亡的主要通路之一，其介导的心肌细胞凋亡与心衰的发生发展及预后密不可分，葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRP78）是内质网的特异性伴侣蛋白，内质网应激时GRP78的表达上调，与跨膜蛋白解离转而与内质网未折叠蛋白结合，可有效抵抗细胞应激，类似于代偿性的抑制内质网应激的信号表达，进而抑制细胞凋亡，但是随着GRP78的过度上调不能维持内质网的稳态，则会激活内质网的下游信号分子C/EBP同源蛋白（C/EBP homolo-gous protein，CHOP），进一步诱导细胞凋亡[10-12]，所以GRP78、CHOP蛋白的上调可以作为内质网应激的标志。故本实验通过采用Real Time-PCR法检测GRP78 mRNA、CHOP mRNA的表达，与正常对照组相比，模型组GRP78 mRNA表达升高（P＜0.05）；
与模型组相比，强心安神方大剂量组GRP78 mRNA表达降低（P＜0.05），实验表明强心安神方大剂量组可以抑制GRP78 mRNA的表达，达到抑制内质网应激从而改善心肌细胞凋亡；
与正常对照组相比，模型组、强心安神方小剂量组、 强心安神方大剂量组、卡托普利组CHOPmRNA表达均升高（P＞0.05）；
与模型组、对照组相比，卡托普利CHOPmRNA表达升高（P＜0.05），结果显示各实验组CHOPmRNA表达无统计学意义，强心安神方抑制内质网应激可能与CHOPmRNA表达无相关性。

综上所述，实验证实强心安神方可以改善心衰大鼠心功能，在一定程度上抑制心肌细胞凋亡，其机制可能与调控GRP78 mRNA抑制内质网应激相关，但是否与调控其他内质网应激标志性蛋白的表达还需进一步研究。