基于高分辨质谱及三重四极杆质谱的蘑菇中7种蘑菇毒素的筛查及定量分析

罗 苹 刘小红 孔 芳 唐 琳 闻 胜 李永刚

（湖北省疾病预防控制中心，应用毒理湖北省重点实验室，武汉 430079）

毒蘑菇亦称毒菌、毒蕈等，是指大型真菌的子实体食用后对人或畜禽产生中毒反应的物种[1～2]。我国已知蘑菇种类估计在4 000种以上，其中可食用的野生蘑菇936种，毒蘑菇435种[3～5]。毒蘑菇具有分布广泛、形态特征复杂、生长环境多变等特点。很多毒蘑菇与可食用野生蘑菇外形类似，人们极易混淆导致误食。由毒蘑菇引起的群体性中毒事件，特别是家庭聚集性中毒事件频发[6]。有数据统计显示，毒蘑菇中毒总体病死率为12.39%，个体致死率高达90%，误食毒蘑菇中毒已经成为我国食物中毒事件中导致死亡的主要原因[7～8]。由于蘑菇的种类不同，所含毒素也不同，已确定的毒性较强且较常见的蘑菇毒素主要有环型多肽类毒素、鹅膏蕈氨酸、毒蝇碱、毒蝇母、鬼伞素、脱磷酸裸盖菇素等[9]。其中，环型多肽类毒素中的鹅膏毒肽分为α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽3种同分异构体；
鬼笔毒肽分为羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽[10～11]。上述几种蘑菇毒素化学性质稳定，日常烹调与加工方式均不能破坏其毒性，故成为蘑菇中毒的主要因素[12～13]。含有鹅膏蕈氨酸、毒蝇母的毒蘑菇主要作用于人体中枢神经系统，会引起不同程度的神经和精神功能障碍[2，14]。

目前，针对蘑菇毒素的检测方法有薄层层析法[15～17]、 放射免疫法[18]、 酶联免疫法[19～20]、 液相 色谱质谱联用法[21～24]等，这些方法仅限于有标准物质状况下的检测运用，而在应对突发公共卫生事件、检测食物中毒致病物质时常面临无标准物质的状况。鉴于此，本研究用高分辨质谱技术[25～27]建库，目的是在发生蘑菇中毒时能快速应对，进行筛查定性，给医生及时救助病人提供必要的技术支持。同时，三重四极杆质谱在准确定量分析化合物方面较高分辨质谱更有优势。因此，本研究拟利用不同的技术手段分别开发筛查和定量方法，拟先采用超高效液相色谱-高分辨质谱法对野生毒蘑菇子实体中5种毒肽（α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽）、1种毒蝇碱（毒蝇母）和1种异噁唑衍生物（鹅膏蕈氨酸）进行筛查，后通过超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法对这7种蘑菇毒素进行确证以及对筛查结果进行定量分析，以建立针对这7种蘑菇毒素的先筛查后确证的定性、定量检测方法，旨在为突发公共卫生事件处置和应急检测提供技术支撑。

（一）试剂甲醇、乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司）；
甲酸（色谱纯，美国Sigma公司）；
标准品α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽、毒蝇母和鹅膏蕈氨酸（纯度≥99%，色谱纯，美国Enzo Life Sciences公司）。

（二）仪器与设备Q Exactive四极杆串联静电场轨道高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；
1290 Infinity II-6495C三重四极杆液质联用仪（美国Agilent公司）；
Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱（美国Waters公司）；
Fresco 17离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；
VXMAL涡旋混合器（德国OHAUS公司）；
AB135-S电子天平（十万分之一，瑞士Metter Toledo公司）；
SB-3200DT超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司）；
FDU-1200冷冻干燥机（日本EYELA公司）；
粉碎机［蚂蚁源科学仪器（北京）有限公司］。

（三）试验方法

1.标准溶液的配制。标准储备溶液的配制：取7种蘑菇毒素标准品各1.0 mg，溶于1 mL乙腈，配制成浓度为1 000 μg/mL的标准储备溶液，置于-20℃下保存。

7种蘑菇毒素的标准工作溶液（10 μg/mL）的配制：准确量取α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽、毒蝇母、鹅膏蕈氨酸标准储备溶液各100 μL，分别加入乙腈定容至10 mL，于-20℃下冷冻保存。

混合标准工作溶液（1 μg/mL）的配制：各取7种蘑菇毒素标准工作溶液（10 μg/mL）100 μL，加入乙腈定容至1.0 mL，混匀，于-20℃下冷冻保存。

2.样品前处理方法。根据《常见化学性食物中毒物质实用检测技术》[28]一书中对蘑菇干粉制备与处理方法的介绍，设计本研究的样品前处理方法。

样品制备：蘑菇样品经冷冻干燥后用粉碎机粉碎成粉末备用。

提取：准确称取蘑菇干粉样品0.20 g于50 mL离心管中，加入8 mL超纯水，超声提取15 min，以10 000 r/min离心10 min，转移上清液至15 mL离心管中。向含残渣的离心管中加入6 mL超纯水，振摇混匀，重复提取一次，离心后合并两次上清液。

净化：依次用2 mL乙腈、2 mL水对HLB柱（100 mg/6 mL）进行活化，再将上述提取液全部过柱，依次向柱内加4 mL水、1 mL甲醇-水溶液（15∶85，V/V）清洗，后用2 mL甲醇-乙腈溶液（2∶8，V/V）洗脱，收集洗脱液进行氮吹，用200 μL甲醇-水溶液（3∶7，V/V）复溶后过0.22 μm滤膜，待测。

3.液相色谱条件。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；
柱温为40℃；
流速为0.3 mL/min；
流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液；
流动相B为乙腈。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

4.高分辨质谱条件。离子源为电喷雾离子源（ESI）；
雾化器流速为11 L/min；
雾化器压力为241.32 kPa；
毛细管电压为3 500 V；
鞘气流速为12 L/min；
鞘气温度为270℃；
传输电压为380 V；
雾化器温度为320℃。

一级全扫方式为正离子扫描；
母离子扫描分辨率为70 000；
扫描范围为m/z150～2 000；
动态隔离窗口为20 s；
自动增益控制进入轨道阱中的离子数（AGC target）为3×106。裂解模式为高能碰撞诱导解离模式（HCD）。

数据依赖二级扫描（dd-MS2）参数：扫描分辨率为17 500；
归一化碰撞能量为20%、40%、70%；
自动增益控制进入轨道阱中的离子数为1×105；
循环次数为20次；
隔离窗口为2.0m/z。

5.三重四极杆质谱条件。离子源为电喷雾离子源（ESI）；
扫描模式为正离子模式；
质谱扫描方式为多反应离子监测；
电喷雾毛细管电压为3.5 kV；
离子源温度为200℃；
雾化器流速为11 L/min；
雾化气压力为241.32 kPa；
雾化气为氮气；
鞘气流速为12 L/min；
7种目标化合物的三重四极杆质谱条件参数见表2。

表2 7种蘑菇毒素的三重四极杆质谱条件参数

（一）超高效液相色谱-高分辨质谱对7种蘑菇毒素的筛查本研究利用超高效液相色谱-高分辨质谱，将各蘑菇毒素的单标溶液在电喷雾离子源正离子（ESI+）扫描模式下，采用全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/dd-MS2）模式结合目标离子列表（Inclusion list）的数据采集方法依次进样分析，由此建立7种蘑菇毒素的靶向筛查数据库。在各蘑菇毒素精确相对分子质量±5范围内手动提取[M+H]+下的提取离子流色谱图（EIC），获得目标化合物的一级母离子精确质量数及保留时间，在其保留时间下进一步提取二级质谱图，获得目标化合物的二级碎片离子信息。建立的靶向筛查数据库包含7种蘑菇毒素的中英文名称、CAS号、化学分子式、理论和实测母离子相对分子质量及其保留时间、主要碎片离子相对分子质量等信息（见表3）。在无标准物质的状况下，可利用该数据库来实现蘑菇中7种毒素的快速筛查。

表3 7种蘑菇毒素的靶向筛查数据库

（二）三重四极杆质谱确证定量参数的优化在确定了7种蘑菇毒素母离子和子离子的基础上，进一步优化三重四极杆质谱参数，使每种蘑菇毒素的离子化效率达到最佳，最终7种蘑菇毒素的三重四极杆质谱条件参数见表2。经过优化，7种蘑菇毒素离子峰峰形较好，响应值高（见图1）。

图1 7种蘑菇毒素定量离子的色谱图

（三）方法学考察

1.线性关系与检出限。取1 μg/mL的混合标准工作溶液，用乙腈逐级稀释成质量浓度分别为20、40、80、160、480、1 000 ng/mL的标准系列溶液，经测定，以目标分析物质量浓度为横坐标，以定量离子对峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，7种蘑菇毒素在20～1 000 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数（R2）在0.996 0～0.999 6之间（见表4），以3倍信噪比（S/N）计算得到7种蘑菇毒素的检出限范围为0.4～5.8 μg/kg，以10倍S/N计算得到其定量限范围为1.3～19.1 μg/kg。

表4 7种蘑菇毒素的线性方程、检出限和定量限

2.精密度与回收率。对空白可食用蘑菇干粉样品进行高（480 μg/kg）、中（160 μg/kg）、低（40 μg/kg）3个浓度水平的加标回收试验，每个水平平行测定4次，外标法定量，结果见表5。7种蘑菇毒素的平均回收率在79.7%～117.3%之间，相对标准偏差（RSD）在1.9%～9.4%之间。

表5 7种蘑菇毒素的添加回收率及相对标准偏差 （%）

（四）实际样品检测应用本研究所建立的方法对湖北省咸丰县、宜昌市、丹江口市、安陆市等地发生的蘑菇中毒事件中采集的蘑菇样品进行了检测。首先，用超高效液相色谱-高分辨质谱对采集的蘑菇样品中的7种蘑菇毒素进行筛查分析，结果显示，咸丰县的野生蘑菇样品中检出4种蘑菇毒素，分别是α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽，其余均未检出；
宜昌市、丹江口市小吃店的蘑菇样品和安陆市木梓乡日常采摘的蘑菇样品中均检出鹅膏蕈氨酸，其余6种未检出。随后，应用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法对检出阳性的蘑菇样品进行定量分析（测定结果均以干重计），结果显示，咸丰县蘑菇样品中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽4种毒素的含量分别为4 049、324、806、1.79 mg/kg；
宜昌市、丹江口市和安陆市木梓乡蘑菇样品中的鹅膏蕈氨酸含量分别为0.036、0.053、0.027 mg/kg。

本研究建立了一种基于高分辨质谱和三重四极杆质谱的蘑菇中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽、毒蝇母、鹅膏蕈氨酸7种蘑菇毒素的筛查及定量方法。该方法能够快速、简单、准确地对蘑菇样品中毒肽类、毒蝇碱及异噁唑衍生物等毒素进行定性和定量分析，适合用于蘑菇中毒等突发公共卫生事件的应急检测及风险评估，可为我国居民的食品安全保障提供技术支撑。