宫颈癌组织中RACK1、IQGAP1表达及与患者临床病理特征和β-连环蛋白相关性

陈 慧 王晓静 汤福想

郑州大学第二附属医院(450014)

有报道[1]显示，激活的白激酶C受体1(RACK1)在恶性肿瘤中高表达，但也有报道[2]显示其可稳定β-连环蛋白(β-catenin)复合物，抑制肿瘤发生，在肿瘤组织中低表达。IQ序列三磷酸鸟苷酶激活蛋白(IQGAPl)是具有协调细胞粘附、迁移作用的一种支架蛋白，能与多种信号分子结合，介导肿瘤的发生发展，但关于其与宫颈癌病理特征关系的报道不多[3]。以往报道[4]显示，宫颈癌分化程度、淋巴结转移等临床病理特征与患者预后关系密切，而宫颈癌呈现不同病理特征，可能是多种分子作用的结果，明确宫颈癌组织RACK1、IQGAP1表达及与临床病理特征关系，有助于为宫颈癌的靶向治疗提供参考。基于此，本文选取近年治疗的宫颈癌患者临床资料，探究宫颈癌组织RACK1、IQGAP1表达及与临床病理特征和β-catenin的相关性。

1.1 一般资料

选取2018年1月-2020年12月在本院行宫颈癌手术治疗的患者为研究对象106例。纳入标准：①符合《国际妇产科联盟(FIGO)2018癌症报告：宫颈癌新分期及诊治指南》中宫颈癌诊断标准[5]，术后病理组织检查确诊；
②签署知情同意书；
③具手术指征；
④术前未接受任何放、化等治疗。排除标准：①合并其他恶性肿瘤或复发、转移性宫颈癌；
②严重心脑血管、肝、肾等功能障碍；
③认知功能障碍或精神性疾病；
④妊娠或哺乳期。本研究经医院伦理学会批准。

1.2 主要仪器和试剂

RNA提取、逆转录、PCR等试剂盒由上海联迈生物工程有限公司生产，紫外分光光度计(B500型)上海元析仪器有限公司生产，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。一抗兔抗人抗体由上海田源生物技术有限公司生产，二抗由北京博奥森生物技术有限公司生产，免疫组化试剂盒等试剂盒均由上海西唐生物生产，苏木精由上海科兴商贸有限公司生产。

1.3 RACK1、IQGAP1、β-catenin表达

1.3.1实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测①提取总RNA：取碾磨好的组织标本，采用RNA提取试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，紫外分光光度计显示吸光度(A)比值A260/A280 ≥1.8，表示提取的总RNA纯度浓度合格。②逆转录：逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。③RT-PCR扩增：cDNA为模板，GAPDH为内参照，采用RT-PCR试剂盒进行扩增，引物序列见表1。PCR反应程序：95℃ 30s预变性，95℃ 5s变性，55℃ 30s退火，72℃ 30s延伸，40个循环。采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.2免疫组织化取宫颈癌手术组织标本，固定、脱水、透明、浸蜡后，石蜡包埋和连续切片，酒精、二甲苯脱蜡，100%、90%、80%、70%梯度酒精脱水，微波高压热修复，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，3%双氧水溶液孵育10min，PBS冲洗，加入兔抗人一抗(抗RACK1、IQGAP1、β-catenin)，滴加羊抗兔二抗，室温孵育30min，PBS反复冲洗3次。加入二氨基联苯胺显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片后显微镜下观察染色情况。PBS代替一抗为阴性对照。RACK1染色定位于细胞核和细胞质，IQGAP1染色定位于细胞膜，β-catenin染色定位于细胞质。根据染色强度和阳性细胞占比半定量法分析评估染色结果，见图1(见插页)。阳性细胞占比，<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～100%为3分；
染色强度，无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，褐色或黑色为3分。染色强度×阳性占比评分>3分为阳性，≤3分为阴性。

1.3 统计学处理

2.1 基本临床资料

患者年龄(46.9±10.2)岁(33～69岁)；
分化程度高分化19例，中分化34例，低分化53例；
病理类型鳞癌87例，腺癌29例；
TNM分期I期39例，II期45例，III期22例；
淋巴结转移67例，无转移39例；
肿瘤直径≥4cm58例，<4cm 48例。

2.2 宫颈癌组织中RACK1、IQGAP1、β-catenin mRNA的相对表达量

RT-PCR结果显示，RACK1 mRNA在宫颈癌组织中的相对表达量低于癌旁组织，IQGAP1 mRNA、β-catenin mRNA在宫颈癌组织中的相对表达量高于癌旁组织(均P<0.05)。见表2。

表2 不同组织标本中各蛋白 mRNA相对表达量比较

2.3 宫颈组织中RACK1、IQGAP1、β-catenin蛋白阳性率比较

宫颈癌组织中RACK1蛋白阳性率低于癌旁组织，IQGAP1、β-catenin蛋白阳性率高于癌旁组织(均P<0.05)。见图1(封三)、表3。

表3 不同组织中各蛋白阳性表达比较(%)

2.4 RACK1、IQGAP1表达与临床病理特征关系

RACK1在高分化、TNM分期为I期、无淋巴结转移的宫颈癌组织中阳性率高于中低分化、TNM分期为II-III期、有淋巴结转移的组织(P<0.05)，但在不同年龄、病理类型、肿瘤直径宫颈组织中阳性率比较未见差异(P>0.05)；
IQGAP1在中低分化、TNM分期为II-III期的宫颈癌组织中阳性率高于高分化、TNM分期为I期组织(P<0.05)，但在不同年龄、病理类型、肿瘤直径、有无淋巴结转移宫颈组织中阳性率比较未见差异(P>0.05)。见表4。

表4 RACK1、IQGAP1表达与临床病理特征关系[例(%)]

2.5 宫颈癌组织RACK1、IQGAP1表达与β-catenin的相关性

相关性分析显示，宫颈癌组织RACK1表达与β-catenin呈负相关(r=-0.405，P=0.000)，与β-catenin呈正相关(r=0.346，P=0.000)。

宫颈癌为常见的一种生殖系统恶性肿瘤，一旦诊断或治疗延迟，易导致宫颈癌发生转移、复发，甚至死亡[6]。目前宫颈癌发病机制尚不完全清晰，多项研究显示，宫颈癌的发生发展影响因素较多，与多基因多信号通路蛋白表达异常有关[7-8]。

RACK1为调控肿瘤细胞转移、侵袭的重要信号因子，可调控Src/NF-kB、PI3K/AKTA、Rho A/Rho、Src/Akt等多个信号通路[9]。既往报道显示，RACK1在口腔鳞癌[10]、乳腺癌[11]中高表达，且与预后关系密切。本研究分析显示，RACK1 mRNA在宫颈癌组织中的相对表达量低于癌旁组织，且RACK1蛋白阳性率低于癌旁组织，提示RACK1在宫颈癌组织中低表达，与周小庆等[2]研究结果一致，但在胡娟等报道中，RACK1蛋白在宫颈癌中高表达，说明RACK1在宫颈癌中的表达存在一定争议，并且可能在不同恶性肿瘤中发挥不同作用。本研究进一步分析显示，RACK1在高分化、TNM分期为I期、无淋巴结转移的宫颈癌组织中阳性率高于中低分化、TNM分期为II-III期、有淋巴结转移，但在不同年龄、病理类型、肿瘤直径宫颈组织中阳性率差异不显著，提示RACK1表达与宫颈癌的发展、分化、转移等有关。

IQGAP1主要是由RasGTP酶活化蛋白相关结构域、钙蛋白同源域、蛋白结构域、C末端RasGAP相关结构域及IQ域组成，在进化过程中可与多种重要信号转导通路结合，参与肿瘤细胞增殖、转移和侵袭等活动[13]。本研究显示，IQGAP1 mRNA在宫颈癌组织中的相对表达量及蛋白阳性率均高于癌旁组织，说明IQGAP1可能通过高表达的方式参与宫颈癌的发生发展。进一步分显示，IQGAP1在中低分化、TNM分期为II-III期的宫颈癌组织中阳性率高于高分化、TNM分期I期组织，但在不同年龄、病理类型、肿瘤直径、有无淋巴结转移宫颈组织中阳性率差异不显著，提示RACK1表达与宫颈癌的发展、分化等有关。其原因可能为IQGAP1可与原癌基因结合，诱导血管内皮生长因子分泌，促进血管生成，而新生血管可为肿瘤细胞的增殖、分裂提供营养物质，从而促进肿瘤生长、浸润。

β-catenin为一种多功能细胞膜内黏着蛋白，可调控肿瘤经典途径Wnt信号通路，而Wnt信号一旦激活可促进细胞迁移、极化，从而诱发肿瘤[14]。既往研究[15]显示，RACK1可调控Wnt/β-catenin通路，使β-catenin降解，从而抑制肿瘤的发生发展。本研究中宫颈癌组织中RACK1表达与β-catenin呈负相关。既往研究[16]显示，IQGAP1表达与β-catenin有关。本研究显示，IQGAP1表达与β-catenin呈正相关，与高蔷[17]等报道结果一致。说明IQGAP1与β-catenin在宫颈癌的发生发展中可能有协同作用，IQGAPl可调节Wnt/β-catenin信号通路，使β-catenin累积，从而刺激下游增殖相关基因表达，进而促进肿瘤细胞增殖。

综上所述，宫颈癌组织中RACK1低表达，IQGAP1高表达；
RACK1蛋白表达异常可能与分化程度、TNM分期、淋巴结转移及β-catenin表达有关，IQGAP1蛋白表达异常可能与分化程度、TNM分期及β-catenin表达有关。本研究仍有一定局限性，如研究样本量较小，可能会影响RACK1、IQGAP1表达及与某些临床病理特征的相关性；
未分析RACK1、IQGAP1表达与β-catenin表达的作用机制，仍需进一步探究。