大黄鱼trim38基因的克隆及其表达分析

苟 涛，王志勇

(1.集美大学水产学院，福建 厦门361021；
2.农业农村部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门361021)

2020年全国大黄鱼(Larimichthyscrocea)养殖总产量25.41万吨，育苗量约24亿尾，均居于我国海水养殖鱼类首位[1]。经研究，福建和浙江近几年发生的大黄鱼内脏白点病，基本上是由恶臭假单胞菌属的变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)引起的[2-5]。研究者们建立了LAMP等特异性快速检测方法[6-8],这有利于尽早介入治疗。变形假单胞菌引起的大黄鱼内脏白点病对大黄鱼养殖产业造成了很大的影响。该病在大黄鱼各养殖区广泛流行，病死率可达50%以上，病鱼体表无明显症状，直到有病死或濒死的个体上浮到海面才会被发觉，此时网箱中多数个体已严重感染，病鱼陆续死亡，严重时整排网箱的鱼几乎死亡殆尽[9-12]。

基于内脏白点病对大黄鱼的危害严重，本实验室通过对817尾人工攻毒幼鱼进行基因组重测序，挖掘获得近1×107个SNP，以攻毒后发病时间作为抗病力表型值进行GWAS分析，精细定位了抗病相关区域，并从上述定位的主效区域中筛选出1个抗病相关基因trim38。trim38是TRIM家族蛋白的一员，该家族蛋白是一类存在于胞浆中、含有保守结构域的蛋白质，目前已经发现70多个成员,它们参与细胞增殖、分化、致癌和程序性死亡等多种细胞活动。近年的研究[13]表明TRIM蛋白在人和小鼠等物种中具有很重要的抗菌抗病毒功能。2010年，刘新蕾等[14]首次发现trim38可能作为一个负向调控天然免疫的分子，trim38可以通过与RIG-1相互作用抑制其与下游效应分子IPS-1、TBK1的结合，从而对于干扰素信号通路起到负向调节的作用。trim38可以激活NF-κB的宿主蛋白[15-17]。trim38可以促进K63和K48相关的细胞蛋白泛素化，可在病毒感染过程中被降解[18]。2014年，胡明明等[19]发现trim38是肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-1(IL-1)触发信号的关键负调节因子。

本研究克隆了大黄鱼trim38基因的ORF序列全长，利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在大黄鱼不同组织的表达情况以及经变形假单胞菌感染后不同时间的表达情况，为阐明大黄鱼在应对变形假单胞菌感染过程中的抗病机制提供了基础资料。

1.1 实验材料

实验所用大黄鱼于2019年2月采集于福建省宁德市金铃水产科技有限公司，体重为(28.0±8.0)g。攻毒前，所有鱼在水温18℃，盐度25左右的条件下驯养1周。动物实验操作遵循集美大学水产学院动物伦理委员会的要求进行。

人工攻毒实验所用变形假单胞菌菌株分离于自然发病鱼，由集美大学水产学院鄢庆枇教授惠赠。攻毒前，将-80℃条件下保存的菌株复苏并接种于含2%NaCl的LB液体培养基，在恒温摇床中180 r/min、37℃培养至OD值A600为1.0左右。用紫外可见分光光度计测量菌液浓度。

1.2 实验试剂

RNA提取试剂盒(TransZol Up Plus RNA Kit)购自北京全式金生物技术有限公司；
逆转录试剂盒(GoScriptTMreverse transcription system protocol，promega)购自上海泰京生物技术有限公司；
琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒和无内毒素质粒小量提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司；
高保真酶(2×Phanta®Max Master Mix)、一步克隆试剂盒(ClonExpress®II One Step Cloning Kit)和荧光定量染料(ChamQTMUniversal SYBR®qPCR Master Mix)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
引物由厦门铂瑞生物科技有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 大黄鱼样品采集

组织表达谱分析：从暂养群体中随机选取6个正常个体,用丁香酚麻醉后，将鱼体置于冰上，用75%酒精擦拭体表，依次剪取鳃、鳍条组织；
随后立即将鱼体解剖，依次取脾脏、肝脏、肠、肾脏和头肾组织；
最后沿大黄鱼头部中线剪开，采集脑组织。将所有样品放置于RNA保护液中，-80℃保存备用。

变形假单胞菌攻毒实验：将培养至1.0×109CFU/mL的变形假单胞菌菌液均匀泼洒到攻毒实验池(池子面积4 m×2 m×0.8 m,水深20 cm)中，至池中菌液终浓度为1.0×106CFU/mL，使细菌与鱼充分接触，并保留一部分不予以攻毒的鱼作为对照组。细菌感染过程持续3 h之后，将所有攻毒实验鱼转移到装有洁净曝气海水的池子中，维持攻毒前的水温和盐度继续养殖，分别在攻毒后3,6,12,24,48,72,96,120 h，在对应的时间点从攻毒组随机捞取6尾大黄鱼，用丁香酚麻醉后快速解剖取其肾脏、脾脏和肝脏，置于RNA保护液中，保存在-80 ℃的冰箱中备用。

1.3.2 总RNA提取及cDNA的合成

采用TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒提取大黄鱼组织样品及经变形假单胞菌感染后的总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA的第一条链。用大黄鱼管家基因β-actin检测反转录效果。引物见表1。

表1 本研究中使用的引物

1.3.3 大黄鱼trim38基因的克隆

从本实验室的大黄鱼基因组测序数据库中获得trim38基因的开放阅读框(ORF)序列，据此设计trim38-F/R引物(序列见表1)，以大黄鱼肾脏cDNA为模板扩增trim38。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收并连接入pMD19-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落送到厦门铂瑞生物科技有限公司进行测序，以验证序列结构。用DNAMAN软件对测序结果和参考序列进行比对分析，并使用Primer Premier 5.0软件(http://www.premierbiosoft.com)设计荧光定量PCR引物qtrim38-F/R(序列见表1)。

1.3.4 大黄鱼trim38基因的生物信息学分析

在网站http://Web.expasy.org/cgi-bin/protparam上分析蛋白质的物理参数；
在网站http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/上预测信号肽；
用DNAMAN软件分析序列同源性；
在网站http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi上预测蛋白结构域；
用BioEidt软件做氨基酸多重序列比对；
用MEGA 6.06软件构建系统进化树。

1.3.5 实时荧光定量PCR

根据trim38 cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物qtrim38-F/R，用稀释50倍的cDNA为模板，选择大黄鱼β-actin基因作为内参基因进行荧光定量PCR(引物序列见表1)，按照荧光定量染料ChamQTMniversal SYBR®qPCR Master Mix说明书进行操作，反应体系：ChamQTMUniversal SYBR®qPCR Master Mix 10.0 μL，qtrim38-F/R各0.5 μL，cDNA模板4.0 μL，加ddH2O至20.0 μL。每个样品进行3个生物学重复，3个技术重复，以确保数据的稳定性。在StepOnePlus 荧光定量PCR仪(美国 Application Biosysterms 公司)上进行qRT-PCR反应，扩增程序为：95 ℃预变性30 s，然后95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。

对实时荧光定量PCR结果，采用2-ΔΔCt方法计算每个样品目的基因的相对表达量。

2.1 trim38基因的结构

克隆获得大黄鱼trim38基因ORF长度为1623 bp，编码540个氨基酸(见图1)，蛋白理论大小为61.58 ku，等电点6.99。SignaIP-5.0 Server和TMHMM Server V.2.0预测结果发现TRIM38蛋白没有信号肽和跨膜区。

NetPhos 3.1 Server预测出TRIM38蛋白含有58个磷酸化位点，其中包括36个丝氨酸(Ser)磷酸化位点，14个苏氨酸(Thr)磷酸化位点,8个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点(见图1)。通过SMART预测表明，TRIM38蛋白从N端到C端依次排列，分别含有1个RING结构域、1个B-box结构域和一个PRYSPRY结构域(见图2)。表2为大黄鱼与其他物种trim38氨基酸序列比较分析结果，从表2中可见，黄姑鱼trim38基因与大黄鱼trim38基因同源性最高，为86.86%；
其次是棘头梅童鱼(84.96%)和鳜鱼(68.63%)。系统进化树(见图3)分析结果显示，鱼类和哺乳类的trim38各自聚为一支，大黄鱼trim38与黄姑鱼的亲缘关系最近。

表2 大黄鱼与其他物种trim38氨基酸序列的同源性分析

2.2 trim38基因在不同组织的表达分析

以大黄鱼β-actin基因为内参，利用实时荧光定量PCR检测大黄鱼trim38基因在鳃、鳍、头肾、脑、脾、肝、肠和肾共八个组织/器官中的表达情况，结果如图4所示。大黄鱼trim38基因在肾脏中相对表达量最高，其次为肝脏和头肾,在其他组织中的相对表达量较低。

2.3 trim38基因在经变形假单胞菌感染后不同时间的表达分析

利用实时荧光定量PCR检测大黄鱼trim38基因经变形假单胞菌感染0，3，6，12，24，48，72，96，120 h后的相对表达量，结果如图5所示。在变形假单胞菌攻毒后，trim38在大黄鱼肝脏与脾脏中的相对表达量迅速提升。在肝脏3 h的相对表达量就达到高峰且达对照组的5.7倍，其后迅速下降，12 h后又逐渐增高，72 h时约增加到开始时的3.0倍，形成1个次高峰，其后又逐渐下降。在脾脏中，攻毒后3 h相对表达量迅速增加到开始时的4.2倍，其后略有下降，但一直维持在开始时的2倍乃至3倍以上，在120 h又大幅度增加到开始时的6.8倍，达到峰值。在肾脏中3 h的相对表达量显著降低，6 h之后恢复至正常水平，其后在起始值的0.5～1.3倍之间波动，在96 h达到最大值，为起始时的1.3倍。

本研究首次克隆出大黄鱼trim38开放阅读框(ORF)全长，其ORF长度为1623 bp，编码540个氨基酸，理论等电点为6.99。生物信息学分析结果表明,trim38具有TRIM家族的主要特征：RING结构域、B-box结构域和PRYSPRY结构域，从N端到C端依次排列。RING结构域是介导蛋白泛素化[21]，可以激活RIG-I信号通路；
B-box结构域能结合锌离子；
PRYSPRY结构域的功能是介导蛋白质之间相互作用[22]。系统进化分析发现鱼类和哺乳类的trim38各自聚为一支。大黄鱼trim38基因与同属于石首鱼科的黄姑鱼和棘头梅童鱼trim38基因同源性较高，与哺乳动物trim38基因同源性相对较低。这可能是因为不同物种所处环境不同，面对不同的环境选择压力，导致不同的进化速度和进化方向[23]。

荧光定量PCR结果显示，trim38基因的mRNA广泛分布于所检测的大黄鱼8种组织或者器官中，在肾脏中相对表达量最高，其次为肝脏和头肾。说明大黄鱼trim38基因在免疫相关组织中高度表达。其同家族基因在大黄鱼中也有类似的作用，例如周真真等[24]报道，大黄鱼TRIM25蛋白在肝脏和头肾相对表达量高。肾脏和肝脏是鱼类的重要免疫器官，上述结果提示trim38在大黄鱼免疫应答过程中发挥着重要作用。

研究发现，TRIM蛋白家族具有很重要的抗菌抗病毒功能，在病毒感染的先天免疫反应中发挥重要作用[25-26]。如trim38通过靶向TRIF降解负性调节TLR3介导的IFN-β信号[27]。TRIM25泛素化可通过正调控激活IRF1促使IFN-β的产生，且能显著激活RIG-I信号通路上的RIG-I和MAVS等基因的上调。TRIM25泛素化激活发挥了抗病毒作用[28]。TRIM37可能通过抑制Wnt/β-catenin通路从而抑制肿瘤的生产[29]。TRIM22在胶质母细胞瘤中可以通过激活PI3K/AKT信号通路和EMT过程来推动肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[30]。本研究大黄鱼感染变形假单胞菌后主要的病变组织器官是脾脏、肝脏和肾脏。在脾脏中，攻毒3 h后相对表达量迅速增加到开始时的4.2倍，其后略有下降，但一直维持在开始时的2倍乃至3倍以上，到高表达后仍持续表达，在120 h又大幅度增加到开始时的6.8倍，达到峰值。该基因在脾脏中表达显著，可能与脾脏作为大黄鱼应对变形假单胞菌感染的主要靶器官有关[3、31]。在肝脏，攻毒3 h时相对表达量就达到高峰，达对照组的5.7倍，其后迅速下降，12 h后又逐渐增高，72 h时约增加到开始时的3.0倍，形成1个次高峰，然后又逐渐下降。在肾脏中，攻毒3 h时相对表达量降低，3 h之后相对表达量上升，在96 h达到最大值，为起始时的1.3倍。初步推测大黄鱼trim38基因有可能参与了大黄鱼抗内脏白点病的免疫应答。

蛋白质泛素化与许多重要的生命过程有密切关系，现已知道其参与信号传导、细胞免疫、炎症反应和调控基因转录等等。研究发现，trim38是一种天然免疫调节剂[32]。作为负调控因子，trim38蛋白介导赖氨酸48(K48)连接的TNF受体相关因子6、TRIF和NF-κB激活激酶相关蛋白1的泛素化，促进其蛋白酶体降解，从而抑制TLR和RLR通路。此外，trim38促进溶酶体依赖的TAK1结合蛋白2(TAB2)在TNF和IL-1b触发的信号中降解，不依赖于它的E3泛素连接酶活性[18]。

但是，关于trim38基因在大黄鱼应对变形假单胞菌感染的免疫应答过程中行使怎样的功能，以及具体的免疫抗病机制，还需进一步的研究阐明。本文为深入研究trim38基因在大黄鱼应对变形假单胞菌感染的抗病免疫机制提供了基础资料。