MicroRNA-133b调节FGFR1-ERK1/2-SOX2信号通路对裸鼠肺癌NCI-H1975细胞移植瘤生长的影响*

褚翔鹏，万人安，王鹏，韩浩，陈小波

[1.日照市人民医院 胸外科，山东日照 276800；
2.云南省肿瘤医院（昆明医科大学第三附属医院） 胸外一科，云南 昆明 650118]

肺癌是指气管、支气管、肺部的恶性肿瘤，其中腺癌占比最高，肺癌发病率、病死率均较高，属于重大公共卫生问题[1-2]。MicroRNA （miRNA）在肿瘤中发挥的作用众所周知，miRNA 可通过影响肿瘤的增殖、凋亡、浸润等参与肿瘤的恶性进展[3-5]。MicroRNA-133b（miR-133b）在包括肺癌在内的多种肿瘤中异常表达，如miR-133b 在胃肠道间质瘤中下调[6]；
miR-133b 可抑制人类抗原R，克服前列腺癌细胞的化疗耐药性[7]；
miR-133b 可通过靶向PKM2基因促进肺癌A549 干细胞增殖，并降低A549 细胞药物敏感性[8]。前期试验表明，体外试验中miR-133b 在肺癌细胞中异常低表达，有关miR-133b 在肺癌体内研究仍缺乏，因此本研究重点探讨miR-133b 在肺癌裸鼠移植瘤中的抑瘤作用，并初步探讨相关机制。WANG 等[9]研究表明，FGFR1-ERK1/2-SOX2 轴为信号促进FGFR1 促进肺癌细胞增殖、上皮间质转化和转移。前期体外实验中，miR-133b 可通过靶向负调控FGFR1 抑制肺癌NCI-H1975 细胞增殖和转移，生物信息网站分析可知miR-133b 与FGFR1 存在结合位点，FGFR1-ERK1/2-SOX2 在肺癌裸鼠移植瘤中如何表达、且与miR-133b 的关系将是本研究研讨的内容。

1.1 动物、细胞与试剂

SPF 级BALB/C 雄性裸鼠40 只[SCXK（苏）2021-0013]购自常州卡文斯实验动物有限公司。人肺成纤维细胞HLF-α（BFN6021545）、肺癌细胞株NCIH1975（BFN608006102）、A427（BFN60870154）、NGE-1（BFN60808930）、A549（BFN608007142）购自青旗（上海）生物技术发展有限公司。miR-133b mimic、mimic NC 由生工生物工程（上海）股份有限公司构建，FGFR1 抑制剂——AZD4547（S2801）购自上海Selleck 生物科技有限公司，CCK-8 试剂盒（C0037）、TUNEL 试剂盒（C1091）、HE 染色试剂盒（C0105S）购自上海碧云天生物技术有限公司，总RNA 抽提试剂盒（12183016）、逆转录试剂盒（4366597）、总蛋白提取试剂盒（89842）购自赛默飞世尔（上海）科技公司，Ki-67（GTX16667）、Cyclin D1（GTX27958）、VEGF-A（GTX21316）、FGFR1（GRX10646）、p-ERK1/2（GTX635617） 、 ERK1/2 （GTX134462） 、 SOX2（GTX101507）、GAPDH（GTX124502）抗体购自美国GeneTex 公司，山羊抗兔（ab6721）购自美国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 qRT-PCR检测人肺成纤维细胞、肺癌细胞株miR-133b 表达提取人肺成纤维细胞HLF-α、肺癌细胞株NCI-H1975、A427、NGE-1、A549 细胞总RNA，将2 μg RNA 逆转录，cDNA 稀释至50 ng/μL 上样。反应体系：共10 μL，miScript SYBR®Green Mix 5 μL，cDNA（50 ng/μL）1 μL，正反向引物各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反应条件：95℃预变性5 s，95℃ 变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共38 个循环。以U6为对照，2-ΔΔCt法计算目的基因miR-133b mRNA 相对表达量。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 荧光显微镜下观察各组细胞的miR-133b 转染效率体外培养NCI-H1975 细胞，于高糖DMEM培养基（添加10%胎牛血清）中培养细胞，并置于5%二氧化碳培养箱中，设置温度为37℃，每2天更换培养基，待细胞生长至80%左右时进行传代。转染前1 天，消化细胞并调整细胞浓度至2×105个/mL，接种在6 孔板上，细胞贴壁至80%左右进行转染，通过Lipofectamine 3000 试剂盒分别转染mimic NC 和miR-133b mimic 作为mimic NC 组和miR-133b mimic组，另常规培养细胞作为对照组。培养24 h 后，荧光显微镜下观察转染效率，转染效率（%）=阳性细胞数/总细胞数。

1.2.3 miR-133b 过表达调控FGFR1 对肺癌细胞NCI-H1975 细胞增殖、迁移的影响将NCI-H1975细胞分为对照组、mimic NC 组、miR-133b mimic 组、miR-133b mimic+pcDNA3.1 组、miR-133b mimic+pcDNA3.1 FGFR1 组。CCK-8 法检测各组NCI-H1975细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（对照组OD 值- 实验组OD 值）/对照组OD 值×100%。Transwell 实验检测NCI-H1975 细胞侵袭、迁移。细胞侵袭：于Transwell 小室中添加Matrigel，37℃固化3 h，加入NCI-H1975 细胞（5×104个），下室中添加RPMI 1640 培养基（含血清，500 μL），培养箱中培养48 h，经多聚甲醛（4%）固定，0.1%结晶紫染色，光学显微镜下观察。细胞迁移：实验步骤除不加入Matrigel 胶外其余步骤均同侵袭试验。

通过Targetscan 网站预测miR-133b 与FGFR1 结合位点。

1.2.4 人肺癌裸鼠移植瘤模型复制并分组取对数生长期细胞消化后，离心弃上清，计数，调整细胞密度，各组小鼠均在后背部接种4×106个细胞，待肿瘤体积变大至100 mm3时，将裸鼠分为对照组、mimic NC 组、miR-133b mimic 组、miR-133b mimic+AZD4547 组，每组10 只。mimic NC 组、miR-133b mimic 组、miR-133b mimic+AZD4547 组采用5 点注射法注射转染试剂（100 μL），对照组以无血清培养基代替，miR-133b mimic+AZD4547 组再额外注射12.5 mg/kg AZD4547[10]。1 次/5 d，共4 次。观察各组小鼠一般状况。

1.2.5 HE 染色观察肿瘤组织变化小鼠最后1 次观测后断头处死，剥离肿瘤，称重并测量肿瘤体积，肿瘤体积=1/2（长径×短径2），将肿瘤置于多聚甲醛中固定，制备石蜡切片。脱蜡水化后，经HE 染色试剂盒进行染色、脱水、透明、封片后，光学显微镜下观察肿瘤组织变化情况。

1.2.6 TUNEL 检测肿瘤细胞凋亡取石蜡切片，TUNEL 细胞凋亡试剂盒进行肿瘤细胞的凋亡检测，光学显微镜下观察，棕黄色染色代表凋亡细胞。凋亡率（%）=（阳性细胞数/总细胞数）×100%。

1.2.7 免疫组织化学法观察小鼠肿瘤组织VEGFA、Cyclin D、Ki-67 表达对石蜡切片进行脱水（梯度法：100%无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、70%乙醇），抗原修复（枸橼酸钠），H2O2封闭，山羊血清封闭，添加VEGF-A、Cyclin D、Ki-67 兔源一抗（稀释比分别为1∶20、1∶500、1∶500），清洗后添加山羊抗兔二抗，DAB 显色，苏木精复染、分化、反蓝、水化、透明、封片，光学显微镜下观察。

1.2.8 Western blotting 检测FGFR1、p-ERK1/2、ERK1/2、SOX2 蛋白相对表达量称量100 mg 移植瘤组织，眼科剪剪碎，加入预冷裂解液匀浆器内匀浆，转移至离心管内，离心（12 000 r/min，15 min）取上清液，置入-80℃冰箱冷冻保存待用。BCA 试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜至PVDF 膜上，封闭，加入稀释一抗FGFR1、p-ERK1/2、ERK1/2、SOX2，稀释比分别为1∶200、1∶200、1∶200、1∶400，以GAPDH（1∶5 000）为内参，封闭，24 h 加山羊抗兔二抗（1∶5 000），封闭，ECL 显色液，分析FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2 蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用t检验；
多组间比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2.1 各细胞miR-133b表达的比较

人肺成纤维细胞HLF-α，肺癌细胞株NCIH1975、A427、NGE-1、A549 中miR-133b mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05），与人肺成纤维细胞HLF-α 比较，肺癌细胞株NCI-H1975、A427、NGE-1、A549 中miR-133b mRNA 相对表达量均降低（P<0.05），其中NCI-H1975 细胞中miR-133b mRNA 相对表达量最低，本研究选择NCI-H1975 细胞作为研究细胞。见表2。

表2 各细胞miR-133b表达的比较 （±s）

表2 各细胞miR-133b表达的比较 （±s）

注：†与HLF-α 比较，P <0.05。

组别HLF-α NCI-H1975 A427 NGE-1 A549 F 值P 值miR-133b mRNA 1.02±0.12 0.16±0.02†0.52±0.06†0.74±0.09†0.46±0.05†106.965 0.000

2.2 miR-133b过表达NCI-H1975细胞

对照组、mimic NC 组、miR-133b mimic 组miR-133b mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05），miR-133b mimic 组miR-133b mRNA相对表达量较对照组和mimic NC 组升高（P<0.05）（见表3）。miR-133b mimic 组的miR-133b 转染效率较高，提示构建的转染细胞株成功（见图1）。

表3 各组细胞的miR-133b转染效率比较 （±s）

表3 各组细胞的miR-133b转染效率比较 （±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；
②与mimic NC组比较，P <0.05。

组别对照组mimic NC组miR-133b mimic组F 值P 值miR-133b mRNA 1.02±0.12 1.01±0.12 3.17±0.39①②154.033 0.000

图1 荧光显微镜下观察的转染效率

2.3 miR-133b 调控FGFR1 对NCI-H1975 细胞增殖、侵袭、迁移的影响

各组细胞增殖抑制率、侵袭细胞数、迁移细胞数比较，差异有统计学意义（P<0.05），与对照组比较，miR-133b mimic 组增殖抑制率升高（P<0.05），侵袭细胞数、迁移细胞数降低（P<0.05）；
与 miR-133b mimic 组 比 较 ，miR-133b mimic+pcDNA3.1 FGFR1 组增殖抑制率降低（P<0.05），侵袭细胞数、迁移细胞数增加（P<0.05）（见表4 和图2）。生信网站预测显示，miR-133b 与FGFR1存在靶向关系（见图3）。

表4 各组细胞增殖抑制率、侵袭细胞数、迁移细胞数的比较 （±s）

表4 各组细胞增殖抑制率、侵袭细胞数、迁移细胞数的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；
②与miR-133b mimic组比较，P <0.05。

组别对照组mimic NC组miR-133b mimic组miR-133b mimic + pcDNA3.1组miR-133b mimic + pcDNA3.1 FGFR1组F 值P 值增殖抑制率/%0 0.54±0.07 32.71±4.67①31.72±4.51 18.24±2.62②154.056 0.000侵袭细胞数/个135.41±19.34 136.67±19.52 66.53±9.50①67.76±9.63 95.54±13.65②31.866 0.000迁移细胞数/个222.72±31.80 234.38±33.48 85.62±12.24①87.36±12.48 132.58±18.95②55.638 0.000

图2 各组细胞侵袭、迁移情况

图3 Targetscan网站预测FGFR1与miR-133b的关系

2.4 各组裸鼠成瘤后情况

裸鼠成瘤后，逐渐萎靡不振，摄食、饮水量均减少，消瘦，皮毛晦暗，双目呆滞，行动缓慢；
转染干预后，miR-133b mimic 组裸鼠症状较mimic NC 组和对照组轻，miR-133b mimic+AZD4547 组症状较miR-133b mimic 组轻。肺癌细胞裸鼠皮下移植瘤均复制成功，成功率100%。

2.5 各组裸鼠移植瘤体积和重量的比较

对照组、mimic NC 组、miR-133b mimic 组、miR-133b mimic+AZD4547 组裸鼠处死时移植瘤重量和体积比较，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-133b mimic 组移植瘤重量较对照组降低，体积缩小（P<0.05），miR-133b mimic+AZD4547 组重量移植瘤较miR-133b mimic 组降低，体积缩小（P<0.05）。见表5 和图4。

图4 各组裸鼠处死后肿瘤形态

表5 各组裸鼠处死时移植瘤重量和体积的比较（n =10，±s）

表5 各组裸鼠处死时移植瘤重量和体积的比较（n =10，±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；
②与miR-133b mimic 组比较，P <0.05。

组别对照组mimic NC组miR-133b mimic组miR-133b mimic+AZD4547组F 值P 值重量/g 0.52±0.06 0.54±0.07 0.21±0.02①0.11±0.01②126.311 0.000体积/mm3 481.82±60.21 523.61±65.45 182.74±22.84①124.62±13.11②115.676 0.000

2.6 各组肺裸鼠移植瘤肿瘤组织病理变化

裸鼠皮下移植瘤与周围组织分界清晰，容易剥除。HE 染色结果显示，对照组、mimic NC 组肿瘤细胞空泡样变性明显、细胞结构消失、细胞红染，miR-133b mimic 组空泡样变性程度较对照组、mimic NC 组轻，miR-133b mimic+AZD4547 组细胞病变程度较miR-133b mimic 组轻。见图5。

图5 各组肺癌裸鼠移植瘤肿瘤组织染色结果 （HE染色×400）

2.7 各组肺癌裸鼠移植瘤肿瘤组织细胞凋亡情况

各组肺癌裸鼠移植瘤组织细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P<0.05），miR-133b mimic 组肿瘤组织细胞凋亡率较对照组升高（P<0.05）；
miR-133b mimic+AZD4547 组较miR-133b mimic 组肿瘤组织细胞凋亡率升高（P<0.05）。见表6 和图6。

图6 各组肺癌裸鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡情况 （TUNEL染色×400）

表6 各组肺癌裸鼠移植瘤肿瘤组织细胞凋亡率比较（n =10，%，±s）

表6 各组肺癌裸鼠移植瘤肿瘤组织细胞凋亡率比较（n =10，%，±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；
②与miR-133b mimic组比较，P <0.05。

组别对照组mimic NC组miR-133b mimic组miR-133b mimic+AZD4547组F 值P 值凋亡率18.24±2.28 19.72±2.46 42.76±6.34①51.72±6.46②72.108 0.000

2.8 各组裸鼠肿瘤组织VEGF-A、Cyclin D1、Ki-67蛋白表达

免疫组织化学检测结果显示，VEGF-A 定位于细胞浆，Ki-67、Cyclin D 均定位于细胞核。miR-133b mimic 组Ki-67、Cyclin D、VEGF-A 阳性细胞比例较对照组低，miR-133b mimic+AZD4547 组VEGF-A、Cyclin D、Ki-67 阳性细胞比例较miR-133b mimic组低。见图7。

图7 各组裸鼠肿瘤组织VEGF-A、Cyclin D1、Ki-67蛋白表达 （免疫组织化学×400）

2.9 各组裸鼠肿瘤组织FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2表达比较

各组裸鼠肿瘤组织FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-133b mimic 组FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2 相对表达量较对照组降低（P<0.05），miR-133b mimic+AZD4547 组FGFR1、 p-ERK1/2/ERK1/2、 SOX2 相对表达量较miR-133b mimic 组降低（P<0.05）。见表7 和图8、9。

表7 各组裸鼠肿瘤组织FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2蛋白相对表达量的比较 （n =10，±s）

表7 各组裸鼠肿瘤组织FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2蛋白相对表达量的比较 （n =10，±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；
②与miR-133b mimic组比较，P <0.05。

组别对照组mimic NC组miR-133b mimic组miR-133b mimic+AZD4547组F 值P 值FGFR1 2.03±0.25 2.01±0.25 0.97±0.12①0.52±0.09②93.671 0.000 p-ERK1/2/ERK1/2 0.86±0.11 0.84±0.10 0.25±0.03①0.13±0.02②151.453 0.000 SOX2 1.38±0.17 1.37±0.17 0.41±0.05①0.11±0.03②440.435 0.000

图8 各组裸鼠肿瘤组织各蛋白表达

图9 各组裸鼠肿瘤组织各蛋白相对表达量的比较（n = 10，±s）

肺癌是我国较常见的恶性肿瘤，治疗靶点的研究是永恒课题。随着miRNA 在肿瘤领域的研究不断深入，许多miRNA 被证实在肺癌中发挥作用。miR-133b 在许多恶性肿瘤中发挥抑癌基因作用，miR-133b 过表达可抑制人胃癌AGS 细胞株增殖、迁移与侵袭[14]；
miR-133b 可通过CTGF 调控卵巢癌上皮间质转化[15]；
miR-133b 通过靶向HOXA9 抑制结直肠癌转移[16]；
miR-133b 可充当LncRNA HOXDAS1 与MMP9 的中间桥梁参与非小细胞肺癌的迁移与侵袭[17]。与人肺成纤维细胞HLF-α 比较，肺癌细胞株（NCI-H1975、A427、NGE-1、A549） 中miR-133b 表达均降低，其中NCI-H1975 细胞中表达最低，因此本研究选取NCI-H1975 细胞作为miR-133b 与肺癌体内实验关系的研究细胞株。本研究细胞实验证实，miR-133b 可通过负调控FGFR1 抑制肺癌NCI-H1975 细胞增殖及迁移，因此复制肺癌NCI-H1975 细胞皮下移植瘤，待裸鼠成瘤后，裸鼠逐渐萎靡不振、摄食、饮水量减少，消瘦，皮毛晦暗，双目呆滞，行动缓慢，肿瘤体积、重量呈升高趋势，满足实验需求。裸鼠处死后，裸鼠肿瘤体积与重量均低于对照组与mimic NC 组，证明miR-133b 在体内也可发挥抑癌作用，与体外实验具有一致性[17]。HE 染色、TUNEL 检测结果显示miR-133b mimic 组空泡样变性程度、细胞凋亡率均降低，提示miR-133b 过表达在抑制NCI-H1975裸鼠移植瘤皮下增长、促进凋亡中发挥关键作用。Cyclin D1、Ki67 是细胞增殖相关蛋白，可作为评价细胞增殖状态指标，可在一定程度上反应肺癌细胞的恶性增殖。新生血管为肿瘤生长提供营养与通道，抑制新生血管的生成也是抑癌的主要手段之一，VEGF-A 可促血管生成。本研究免疫组织化学检测结果发现，miR-133b 过表达可降低VEGF-A、Cyclin D1、Ki67 阳性表达，微血管密度降低，即miR-133b 过表达可抑制NCI-H1975 细胞体内增殖与新生血管生成而延缓肿瘤生长速度。

FGFR1 在肺癌中被广泛研究，被认为是调控肺部肿瘤侵袭、迁移的关键靶点，其激活可增强肺部肿瘤干细胞样特性与抗凋亡能力，同时可观察到SOX2 的上调[18]。SOX2 是肿瘤干性标志物，可调控肺癌的肿瘤生长，其激活可促进肿瘤的侵袭转移[19]。实体瘤的致死与肿瘤的侵袭转移关系密切。FGFR1 上调SOX2 的机制与其激活多种下游通路有关，MAPK 是FGFR1 的关键下游[20]。FGFR1/MAPK 在多种肿瘤细胞的生物学进展中属于关键一环。WANG 等[9]研究显示，FGFR1 抑制可通过促使下游ERK1/2 磷酸化进而上调SOX2 表达，促进肺癌细胞增殖。上皮间质转化与转移；
LIN 等[21]研究显示，FGF21 通过FGFR1-ERK1/2-Elk-1 途径抑制HepG2 细胞载脂蛋白的表达；
FANG 等[22]研究显示，SOX2 与FGFR1 升高与小细胞肺癌患者的预后不良相关；
本研究中，miR-133b 过表达可降低p-ERK1/2、SOX2 相对表达量，提示miR-133b 过表达抑体内移植瘤的作用可能是通过FGFR1-ERK1/2-SOX2 轴实现的，但具体机制仍待进一步分析。为此本研究通过瘤内注射FGFR1 抑制剂AZD4547，发现AZD4547 可进一步加大miR-133b 过表达导致的抑瘤作用。因此笔者认为miR-133b 过表达对裸鼠肺癌NCI-H1975 细胞皮下移植瘤生长具有抑制作用，且可能是通过调控FGFR1-ERK1/2-SOX2 信号通路实现的。

综上所述，miR-133b 过表达可能通过抑制FGFR1-ERK1/2-SOX2 轴，对裸鼠肺癌NCI-H1975细胞皮下移植瘤生长具有抑制作用。但本研究也存在一定不足，仅用FGFR1 抑制剂验证了FGFR1在FGFR1-ERK1/2-SOX2 中发挥的作用，下一步将继续尝试使FGFR1 过表达观察小鼠肿瘤的变化，并对其下游机制进行充分验证。