基于种植环境对次生代谢产物影响下的广陈皮与陈皮对比研究

石洪超 商雪莹 陈明权 罗卓雅 覃仁安 何风雷 孙 东

1.广州白云山陈李济药厂有限公司，广东广州 510288；
2.广东省药品检验所，广东广州 510663

中药材次生代谢物的含量和各成分间的比例，会因栽培环境条件的变化而变化[1-2]，黄璐琦等[3-4]提出道地药材形成的逆境效应理论，也有其他学者[5-6]认为合成和积累次生代谢产物是药用植物适应环境胁迫的策略，常见的环境胁迫包括温度[7]、光照[8]、水分[9]、土壤因子等[10]。

不同产地的陈皮价格存在巨大差异，史料记载[11-12]橘皮以广中来者胜，称为广陈皮，其中以广东新会种植茶枝柑所产的广陈皮质量最优，业内称为“新会陈皮”。随着2020 版《中华人民共和国药典》[13]对“广陈皮”项的修订，广陈皮产业得到了极大的发展。2021 年新会陈皮全行业产值已达145 亿[14]，广东省江门市地方标准《DB4407/T70-2021 地理标志产品新会陈皮》[15]中规定，在新会地理标志产品保护范围内栽培并储存陈化3 年以上的称为“新会陈皮”。鉴于新会地区独特的水土环境[16]，“广陈皮”与其他产地的“陈皮”中次生代谢产物有所差别。目前研究已证实，新会陈皮中橙皮苷含量低于其他陈皮，但川陈皮素和橘皮素较高，且多氧基黄酮的含量较多[17-18]。因此，本研究从次生代谢产物的角度出发，探索通过比较黄酮类成分间的比值区分不同产地陈皮的可行性。

1.1 材料

1.1.1 仪器

Thermo QE plus 液相色谱串联高分辨质谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；
Waters H-Class UPLC-PDA Detector 超高效液相色谱（美国沃特世公司）；
Waters XSelect CSH C18色谱柱（2.5 μm，3.0 mm×100 mm，美国沃特世公司）；
Waters XSelect HSS T3 色谱柱（2.5 μm，3.0 mm×150 mm，美国沃特世公司）；
Waters CORTECS C18色谱柱（2.7 μm，3.0 mm×150 mm，美国沃特世公司）；
XPR 26/A 百万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；
Sartorius BS420S 万分之一电子天平；
Milli-Q Reference 纯水机（法国Millipore）；
SB-5200 DT超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；
WXJ型粉碎机（上海凯旋中药机械制造有限公司）。

1.1.2 试剂与试药

维采宁-2（纯度：99.57%，批号：19121201，成都格利普生物科技有限公司）；
橙皮苷（纯度：96.1%，批号：110721-201617，中国食品药品检定研究院）；
川陈皮素（纯度：98.0%，批号：AF7122105，成都莱宝科技有限公司）；
橘皮素（纯度：98.0%，批号：AF8012603，成都莱宝科技有限公司）；
甜橙黄酮（纯度＞98.0%，批号：PS011272，成都普思生物科技股份有限公司）；
6-去甲氧基橘皮素（纯度＞98.0%，批号：PS011274，成都普思生物科技股份有限公司）；
5-去甲基川陈皮素（纯度＞98.0%，批号：PS020360，成都普思生物科技股份有限公司）；
色谱级甲醇（德国Merck）、超纯水、甲醇（广州化学试剂厂）、磷酸、甲酸（广州化学试剂厂）。

1.1.3 试验样品信息

样品分别编号为S1～S18，样品S1～S14 经广州中医药大学中药鉴定教研室主任黄海波副教授鉴定为芸香科植物茶枝柑Citrus reticulate‘Chachi’的果皮，即广陈皮，其中包括种植于新会地区的新会陈皮（S1～S8，以下简称“新会陈皮”）及同属茶枝柑种植于两广其他地区的广陈皮（S9～S14，以下简称“非新会广陈皮”）；
样品S15～S18 经鉴定为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco 及除茶枝柑以外的其他栽培变种的果皮，即陈皮，样品信息见表1。

表1 不同产地陈皮样品信息表

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备

取维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、甜橙黄酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陈皮素标准品，精密称定，分别用甲醇配置成浓度为0.552、0.523、0.542、0.604、0.426、0.513、0.419 mg/ml 的标准品溶液，置于4℃冰箱中保存。

取维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素标准品储备液1 ml，加入甲醇配置为10 ml 的混合标准品溶液，用于不同产地陈皮的UPLC 图谱研究。取橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、甜橙黄酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陈皮素标准品储备液1 ml，加入甲醇配置为10 ml 的混合标准品溶液，用于黄酮类成分分析研究。

1.2.2 供试品溶液的制备

取陈皮样品0.5 g（过45 目筛），精密称定，置于150 ml 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，超声处理30 min（功率300 W，频率40 kHz），放置至室温，称重补重，经0.22 μm 微孔滤膜过滤即得。

1.2.3 UPLC 色谱条件

采用Waters H-Class UPLC-PDA Detector 超高效液相采集色谱图；
色谱柱：Waters XSelect CSH C18色谱柱；
柱温：30℃；
流速：0.5 ml/min；
进样量：2 μl；
流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；
洗脱程序为0～2 min 10%A，2～12 min 10%→15%A，12～17 min 15%→30%A，17～18 min 30%A，18～22 min 30%→45%A，22～23 min 45%→50%A，23～25 min 50%A；
检测波长：283 nm。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液2 μl，按“1.2.3”项下色谱条件进样6 次，分别积分并记录橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、甜橙黄酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陈皮素的峰面积值，计算相对标准偏差。

1.2.4.2 重复性试验 精密称取同一供试样品（S4）6 份，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液并按“1.2.3”项下色谱条件进行检测，记录峰面积，计算相对标准偏差。

1.2.4.3 稳定性试验 取S4 供试品溶液，分别在0、4、8、12、24、48 h 按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算得橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、甜橙黄酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陈皮素的峰面积相对标准偏差。

1.2.4.4 方法的耐用性考察 取S4 供试品溶液，分别在3 根不同色谱柱上进行耐用性考察。记录在同一检测波长下（283 nm）6 个成分峰的保留时间及峰面积，计算橙皮苷与其他5 个成分峰之间的相对保留时间比值和相对峰面积百分比，计算相对标准偏差。

1.2.5 质谱条件

采用Q Exactive Orbitrap 高分辨质谱进行质谱数据采集，检测模式为Full MS-ddMS2，正离子模式扫描，扫描范围为m/z 100～1 200，MS1分辨率设置为70000，MS2分辨率设置为17 500，离子源电压为3.2 kV，毛细管离子传输管温度为320℃，辅助气加热温度为350℃，鞘气流速为40 L/min，辅助气流速为15 L/min，AGC Target 设置为1e6，Top N 设置为5，触发MS2扫描的碰撞能量采用阶梯式碎裂电压NCE，设置为30、40、50。

1.2.6 数据分析

1.2.6.1 质谱数据 采用Compound discover 3.2 软件进行原始Raw 质谱数据特征峰提取，特征峰元素匹配、分子式预测及同位素分布匹配的质量偏差均设置为＜5 ppm。采用mz cloud 在线数据库和本地自建mz Vault 中药天然产物数据库进行特征峰鉴定，指认结果筛选标准为质量偏差＜5 ppm、符合同位素分布及mz Vault best match 数据库匹配得分＞70 分。通过与对照品对照、谱库检索、裂解碎片及文献检索，对样品中的化合物进行指认和确认。

1.2.6.2 液相数据 取“1.1.3”项下样品，每个样品平行2 份，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液并按“1.2.3”项下色谱条件进行检测，记录6 个成分的峰面积，将6 个成分的峰面积，一个作为分子，另一个作为分母进行两两组合，形成比值。

2.1 不同产地陈皮的UPLC 图谱

不同产地陈皮的光谱吸收有差异，初步选择8 个差别峰进行产地鉴别研究，其中采用对照品比对3 个已知峰（橙皮苷、川陈皮素和橘皮素），还有5 个未知峰需进行鉴别指认。见图1。

图1 S4、S12、S16 样品UPLC 色谱图

2.2 黄酮类成分定性分析

通过与对照品对照、谱库检索、裂解碎片及相关文献，对样品中的5 个未知峰进行化合物指认，且其均为黄酮类成分，化合物3 为甜橙黄酮，化合物4 为6-去甲氧基橘皮素，化合物5 为5-去甲基川陈皮素；
同时初步指认化合物1 为柚皮素查尔酮，化合物2 为异樱花素，但未采用对照品确认，总离子流图及对照品对照图谱见图2。

图2 正离子模式下总离子流图

鉴于后续的研究需采用差异性黄酮类成分峰面积的比值分析，因此选择6 个已用对照品确认的化合物，即化合物3（甜橙黄酮）、化合物4（6-去甲氧基橘皮素）、化合物5（5-去甲基川陈皮素），以及橙皮苷、川陈皮素、橘皮素进行峰面积比值分析。

2.3 不同产地陈皮样品中黄酮类成分的比值分析

2.3.1 方法学考察

2.3.1.1 精密度试验 橙皮苷（RSD=0.57%）、川陈皮素（RSD=0.52%）、橘皮素（RSD=0.61%）、甜橙黄酮（RSD=0.71%）、6-去甲氧基橘皮素（RSD=1.21%）、5-去甲基川陈皮素（RSD=1.45%）的RSD 值均＜2%，提示仪器的精密度良好。

2.3.1.2 重复性试验6 个成分的峰面积RSD 值分别为1.27%、1.52%、1.33%、3.15%、4.03%、2.10%，提示方法重复性良好。

2.3.1.3 稳定性试验6 个成分的峰面积RSD 值分别为1.03%、1.11%、0.76%、3.62%、2.57%、1.85%，提示供试品溶液在48 h 内稳定。

2.3.1.4 方法的耐用性考察 经3 根不同的色谱柱的测定结果对比发现，在色谱柱1、色谱柱2 上，6 个成分峰均能有效分离，且各差异峰的峰面积、保留时间与原方法建立时使用的色谱柱3 测定结果接近（RSD＜5%），结果见表2，提示该方法具有良好的耐用性。

表2 方法耐用性考察表

2.3.2 样品测定

各成分峰面积经排列组合得到15 组比值，结合表1 中的样品信息分析发现，能区分不同产地陈皮的比值有2 组，见表3。由比值数据可知，当陈皮峰面积比值甜橙黄酮/6-去甲氧基橘皮素＞0.60 时，可将其判断为广陈皮（包括新会陈皮、非新会产广陈皮）；
≤0.60 可将其判断为陈皮。且当峰面积比值橘皮素/5-去甲川陈皮素＞7.00 时，可将其判断为新会陈皮、非新会产广陈皮；
≤7.00 可将其判断为陈皮。

表3 样品中可用于区分的峰面积比值（n=2）

本研究发现6 个潜在的黄酮类成分[19-20]可用于区分广陈皮与陈皮，分别为橙皮苷、甜橙黄酮、6-去甲氧基橘皮素、川陈皮素、橘皮素、5-去甲基川陈皮素，经过峰面积比值分析后发现，有2 组峰面积比值（283 nm 下）可用于判断广陈皮与陈皮，即甜橙黄酮/6-去甲氧基橘皮素＞0.60 或橘皮素/5-去甲基川陈皮素＞7.00，可将其判断为广陈皮。该比值可用于陈皮品种的快速分析，且不受陈化年份、陈化方式等因素的影响。

目前关于陈皮产地的鉴别研究中有HPLC 指纹图谱[21]、红外光谱[22]、矿质元素[23]、基因组DNA[24]等方法，在陈皮物质基础方面主要有指纹图谱及成分含量方面的研究，但指纹图谱及含量测定[25]多存在检测过程较冗繁或需复杂的化学计量法等问题。本研究基于中药材次生代谢产物含量和各成分间的比例因环境条件的变化而变化，利用差异指标成分间的比例差异作为区分陈皮产地区分的指标具有一定的科学性，并且通过计算在同一检测波长下差异成分之间的峰面积比值，可提高产地区分指标的便捷性和普适性。但对于新会陈皮和非新会广陈皮而言，黄酮类成分比值无法对两者进行区分，后续还需增加其他指标探索两者区分的可能性。