基于多级互相关的RDW高分辨率检测与表征方法*

刘 跃, 刘 超, 张文昌

(1.北京信息科技大学 仪器科学与光电工程学院,北京 100192；
2.中国科学院微电子研究所 微电子器件与集成技术重点实验室,北京 100029)

红细胞分布宽度(red blood cell distribution width,RDW)是红细胞体积异质性的表征参量,可以直接反映红细胞体积统计学分布特性(变异系数、标准差等),是血常规重要的检测指标之一,对于多种疾病的诊疗及预后具有重要的临床参考价值。国内外大量研究表明,急慢性心力衰竭、心肌梗死、高血压等心血管疾病会导致红细胞大小、形态和变性能力发生改变[1],心血管疾病的发病及预后与RDW呈现一定的相关性[2]。此外,RDW在风湿关节炎、乙肝、恶性肿瘤性贫血、胆道狭窄、脓毒症[1,3]、Ⅱ型糖尿病[4]等疾病的进展及疗效评估中也具有重要的参考价值。因此,对红细胞体积进行准确检测实现高分辨率RDW检测及表征具有重要的临床意义和应用价值。

RDW的检测及表征是基于大量红细胞体积检测结果的统计学分析,目前单细胞体积检测方法主要包括流式细胞分析法和库尔特电子体积法[5～7]。然而,典型激发光斑的光强具有高斯分布特性,细胞流经激发光斑的位置具有一定的随机性,从而导致前向散射光检测方法易受随机误差的影响。另一方面,库尔特电子体积法由于检测孔附近电场分布不均匀,细胞流经检测区域引起的电流变化同样存在一定的随机误差。

为了减小随机误差的影响,国内外多个课题组依托于微流控芯片流道尺寸与细胞粒径高度适配的特性,对基于微流控技术的细胞体积检测方法开展了大量的研究。Riordon J等人[8]提出了一种带有气动阀的微流控细胞体积检测方法,通过控制阀腔对检测通道高度进行动态调控减小细胞位置偏差；
Sun T等人[9]对双电极测得的差分信号的时间相关特性进行了分析,实现了信号的高信噪比提取；
Emaminejad S等人[10]基于多电极的差分输出信号进行分析,并分别利用3种参数对细胞粒径实现了准确表征；
文献[10]利用多对楔形结构电极对脉冲信号进行调制,实现了微流道内细胞位置的判定与误差校正；
Errico V等人[11]利用1个激励电极、2个感应电极进行单细胞检测,通过对2路输出信号做差分运算得到的正负峰值间的时延量进行位置影响修正。以上方法充分显示了微流控技术在单细胞特性分析方面的独特优势,在一定程度上解决了细胞位置引起的随机误差影响。然而,多电极结构微流控芯片制备过程繁琐,对齐键合工艺难度较大,芯片之间检测结果重复性较差。另外,基于信号强度表征的细胞体积统计分析方法依赖于时域信号(前向散射光强度、电流)的检测准确率,系统鲁棒性较差。

针对以上问题,本文基于库尔特电子体积检测方法,提出了一种结合微流控技术与多级互相关分析(multiple cross-correlated analysis,MCCA)的高分辨率细胞体积检测及表征方法。利用多级检测微流道结构实现单细胞的多次、顺序、独立检测,减小随机误差的影响。结合MCCA对多级脉冲信号进行时间相关特性分析,获取互相关系数峰值作为统计分析参量,提高体积分辨率,减小体积相近细胞的分布重叠率。最后,以3 μm聚苯乙烯微球(3 μm)、健康人红细胞(RBCs)和Ⅱ型糖尿病人红细胞(DM-RBCs,RDW增大)为检测样本,分别进行单样本标定和混合样本(3 μm+RBCs、3 μm+DM-RBCs)重叠率减低验证实验,对高分辨率RDW检测及表征方法的有效性进行验证。

1.1 多级脉冲信号获取与MCCA

气动进样单细胞多级检测的原理示意如图1(a)所示,鞘液与样本液在压力源的驱动下在微流道内形成层流,利用流体动力学聚焦作用把细胞位置限定在一定的范围内减小位置偏差的影响,并利用置于检测区域的两侧1对Ag/AgCl电极,对细胞流经检测孔时的电流变化量进行检测。多级检测孔由大尺寸缓冲区分隔,多级检测为相互独立,细胞流经检测孔位置保持随机性。

图1 高分辨率RDW检测与表征原理示意

假定微流控芯片具有n级检测孔,当单细胞流经检测区域时,会产生n个带有直流基线IDC的电流变化脉冲fi(t)(i=1,2,…,n),如图2所示。利用高斯函数建模,可表示为

图2 多重互相关分析示意

(1)

式中 ΔIi(i=1,2,…,n)为常数,表示当前脉冲峰值的幅值,A；
σ为脉冲宽度,s；
τi-1为f1(t)与fi(t)间的时间延迟,s。

相对于系统噪声等随机性干扰信号,多脉冲电流信号具有时间相关特性,利用互相关分析方法可以有效提高信噪比,减小干扰影响。假设细胞流动速度恒定,n个脉冲的峰值相等(ΔI1=ΔI2=,…,=ΔIn),对互相关函数M进行推导可得[12]

(2)

1.2 重叠率降低原理

(3)

对于包含多种粒径细胞的混合样本,以ΔI为参量进行统计分析时,体积相近的细胞会由于检测偏差产生分布重叠,如图3所示,以M为表征参量进行统计分析可以有效减小重叠率,即MCCA算法可以有效提高细胞体积分辨能力。

图3 重叠率降低示意

基于以上理论分析,对微流控芯片检测孔级数对重叠率的降低效果进行了仿真分析,确定实验所需检测级数为n=5。(重叠率小于0.2 %)。搭建了多级互相关RDW高分辨率检测系统,并以3 μm、RBCs、DM-RBCs为检测样本,分别进行了单样本标定实验以及混合样本(3 μm+RBCs、3 μm+DM-RBCs)重叠率降低验证实验。

2.1 系统搭建与样品制备

实验采用PDMS+玻璃结构的微流控芯片,制备过程主要包括芯片设计与掩模版制备、SU8模具制备、PDMS浇筑倒模以及PDMS与玻片不可逆键合4个过程。经过2层光刻制备的微流控芯片流道具有2种深度:检测孔深度约6 μm,缓冲区深度约12 μm,微流道其他区域的深度与缓冲区的深度相同。综合考虑系统信噪比以及堵塞概率,最终确定检测孔宽度为6 μm,如图1(b)所示。

验证实验包括标定实验和混合实验两部分,为减小微球聚集,达到理想的单分散效果,含有3 μm微球的样本中均添加0.1 %的Tween—20溶液,并超声振荡1 min。单颗粒标定样本:分别将15 μL 3 μm微球、RBCs、DM-RBCs与3 mLPBS混合,制备单颗粒样本悬浮液；
混合样本:将15 μL 3 μm微球、15 μL RBCs与3 mL PBS混合,制备3 μm+RBCs的混合悬浮液；
将15 μL 3 μm微球和15 μL DM-RBCs与3 mL PBS混合制备3 μm+DM-RBCs混合悬浮液。

通过Ag/AgCl电极施加在微流道两端的直流激励信号幅值约为200 mV；
样本液与鞘液的压力源气动进样压力为0.3～0.5 psi(1 psi=6.895 kPa)；
利用DHPCA—100电流放大器(Femto,德国)对流道内电流信号进行检测(增益106)及I/V转换；
输出信号经NI PCI—6363(16 bit,100 kHz)采集后利用MATLAB进行离线分析。

2.2 单颗粒样本标定结果分析

由库尔特电子体积检测原理可知,细胞流过检测孔产生的电流下降幅值与细胞/检测孔的相对体积比例成正比。利用不同尺寸的微流道结构对同一样本的检测结果存在一定的偏差。因此,需要分别对3 μm微球、RBCs及DM-RBCs进行单颗粒样本标定实验。仅限于本文微流道尺寸结构及检测系统,3 μm微球、RBCs及DM-RBCs的单颗粒样本标定结果如图4所示。

图4 单颗粒样本标定实验结果

其中,图4(a),(e),(i)分别为10.5 s内3 μm微球、RBCs及DM-RBCs流经检测区域的电流变化曲线；
图4(b),(f),(j)分别为单个3 μm微球、RBCs及DM-RBCs流经检测区域产生的5级电流脉冲曲线。由电流脉冲曲线可知,单颗粒经过5级检测孔时脉冲峰值ΔI具有一定的偏差,并且不具有特定的变化规律,在一定程度上表明了对单细胞进行多次检测的必要性。图4(c),(d)为4 805个3 μm微球的统计分析结果:以ΔI为表征参量,ΔI的分布范围为0.48～3.59 nA,平均值为1.88 nA,标准差为0.48 nA；
以M为表征参量,分布范围为109.72～1010.42。图4(g),(h)为10 863个RBCs的统计分析结果:以ΔI为表征参量,ΔI的分布范围为2.69～15.00 nA,平均值为8.28 nA,标准差为1.96 nA；
以M为表征参量,分布范围为1010.37～1011.02。图4(k),(l)为7 825个DM-RBCs的统计分析结果:以ΔI为表征参量,ΔI的分布范围为2.21～24.32 nA,平均值为10.91 nA,标准差为2.61 nA；
以M为表征参量,分布范围为1010.28～1011.42。利用该标定实验的统计分析结果,可以实现后续混合样本实验重叠界限以及重叠率的计算。

2.3 混合样本检测结果分析

在此基础上,以3 μm微球作为参考颗粒,分别进行3 μm+RBCs和3 μm+DM-RBCs混合样本实验,对基于MCCA方法的RDW高体积分辨率检测及表征方法的可行性进行验证。混合样本(3 μm+RBCs、3 μm+DM-RBCs)实验结果如图5所示。

图5 混合样本实验结果

其中,图5(a),(e)分别为7.5s内3 μm+RBCs样本及3 μm+DM-RBCs样本流经检测区域的电流变化曲线；
图5(b),(f)分别为相应的局部放大5级电流脉冲曲线。图5(c),(d)为15 602个3 μm+RBCs的统计分析结果:以ΔI为表征参量,重叠区间[2.69,3.59]nA的重叠率为3.22 %；
以M为表征参量,重叠区间[1010.37,1010.42]的重叠率降至0.72 %。图5(g),(h)为2 698个3 μm+DM-RBCs的统计分析结果:以ΔI为表征参量,重叠区间[2.21,3.59]nA的重叠率为12.08 %；
以M为表征参量,重叠区间[1010.28,1010.42]的重叠率降至1.93 %。

本文结合微流控技术与多级互相关分析算法提出一种RDW高分辨率检测及表征方法。利用具有多级检测孔的微流控芯片对单细胞进行顺序多次检测,得到具有时间相关特性的多脉冲电流信号,减小单次检测随机误差的影响。利用MCCA算法对时域信号进行多级互相关分析,并以最大相关系数为表征参量对统计分布特性进行分析。实验结果表明：相比于传统基于单次检测和以峰值为表征参量的统计分析方法,基于MCCA的RDW检测及表征方法可以有效提高颗粒体积分辨能力,降低重叠率。本文方法可以广泛推广到其他特征参量的单微粒表征及计数方面的研究。