lncRNA,SNHG10下调miR-154-5p对非小细胞肺癌细胞的影响

万冬冬，徐 俊，储赏奇

南通市海门区人民医院:1.肿瘤科;2.呼吸与危重症医学科，江苏南通 226100

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的最主要原因，每年导致160万人死亡[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型，多数患者确诊时，通常处于晚期或已发生转移[2]。紫杉醇(PTX)是NSCLC常用化疗药物，但长期治疗后，部分患者可产生耐药性，严重影响化疗疗效[3]。探讨NSCLC的PTX耐药机制，可为临床治疗提供新的思路，使更多患者从中受益。长链非编码RNA(LncRNA)在药敏、耐药肺癌细胞中异常表达，可能影响化疗耐药性[4]。研究发现，小核仁RNA宿主基因10(SNHG10)是肝癌中的一种致癌LncRNA，其在NSCLC癌组织中表达下调，过表达SNHG10可抑制NSCLC细胞增殖[5]。LncRNA可作为竞争性内源性RNA(ceRNA)与靶mRNA竞争性结合对抗微小RNA(miRNA)，发挥海绵活性，抑制miRNA功能，影响肿瘤的发生、发展[6]。了解上述干扰方式，可为疾病发展及治疗提供新思路。miR-154-5p在多种癌症中异常表达，NCBI的GEO数据库显示，miR-154-5p在NSCLC中表达上调[7]。此外，Sratbase数据库在线预测SNHG10与miR-154-5p存在结合位点，二者均在NSCLC中发挥调控作用，但与PTX耐药性的关系尚未可知。因此本研究通过分析SNHG10对NSCLC细胞增殖、迁移及PTX耐药性的影响及可能机制，以期为逆转NSCLC患者PTX耐药提供理论支持。

1.1主要材料及仪器 人NSCLC A549细胞株购自美国ATCC公司；
MTT试剂盒(C0009S)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010S)购自上海碧云天生物技术有限公司；
Dual Luciferase试剂盒(E1910)购自美国Promega公司；
多药耐药相关蛋白1(MRP1)、微小染色体维持蛋白(MCMP)、Bcl-2、Bax、β-actin兔单克隆抗体(ab233383、ab218242、ab32124、ab32503、ab213262)购自英国Abcam公司；
TRIzol试剂(15596018)、High Capacity cDNA反转录试剂盒(4368813)、LipofectamineTM2000试剂(11668-027)购自美国Invitrogen公司；
紫杉醇注射液(国药准字H20059962)购自哈药集团有限公司；
pcDNA-SNHG10、pcDNA阴性对照(pcDNA-NC)、miR-154-5p抑制物(anti-miR-154-5p)、抑制物阴性对照(anti-NC)、miR-154-5p类似物、mimics阴性对照(miR-NC)质粒均由自上海吉玛制药技术有限公司提供。

实时荧光定量PCR(qPCR)仪(型号：QuantStudioTM3，美国Applied Biosystems公司)，酶标仪(型号：Multiskan GO，美国ThermoFisher公司)；
电泳仪、蛋白转膜装置(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组 在RPMI 1640培养液(含100 mg/mL链霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清)中培养A549细胞，37 ℃、5%CO2，细胞密度达85%以上，传代培养。将对数期A549细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，LipofectamineTM2000试剂盒分别或同时将pcDNA-SNHG10、pcDNA-NC、anti-miR-154-5p、anti-NC、miR-154-5p mimics与pcDNA-SNHG10、miR-NC与pcDNA-SNHG10质粒转染至A549细胞，记为pcDNA-SNHG10组、pcDNA-NC组、anti-miR-154-5p组、anti-NC组、miR-154-5p mimics+pcDNA-SNHG10组、miR-NC+pcDNA-SNHG10组；
每组6个复孔。

1.2.2双荧光素酶报告实验验证SNHG10与miR-154-5p的靶向关系 生物信息网站Starbase预测，SNHG10与miR-154-5p有结合片段。构建野生型SNHG10-WT质粒，并利用基因定点突变技术构建突变型SNHG10-MUT质粒，由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。将miR-154-5p mimics、miR-NC与SNHG10-WT、SNHG10-MUT共转染A549细胞，采用Dual Luciferase试剂盒检测各组A549细胞荧光素酶活性。

1.2.3MTT法检测细胞增殖及PTX敏感性 细胞增殖：各组A549细胞接种至96孔板(2×103个/孔)，各孔加200 μL RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)，37 ℃、5%CO2培养24 h，加MTT溶液(20 μL/孔)，培养4 h，加DMSO(150 μL/孔)，震荡5 min，酶标仪测定490 nm处吸光度值(A490)，计算细胞增殖抑制率[(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100%]。PTX敏感性：分别在培养基中加入1、5、10、20、40 nmol/L PTX，培养48 h，其余步骤同细胞增殖。计算药物半数抑制浓度(IC50)值。

1.2.4Transwell检测细胞迁移、侵袭 迁移实验：采用无血清RPMI 1640培养液将各组A549细胞密度调整为1×105个/mL。Transwell小室上室加入细胞悬液100 μL，RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)500 μL加入下室中。培养48 h，多聚甲醛固定、结晶紫染色，倒置显微镜下观察、记录穿膜细胞数。

侵袭实验：将Matrigel基质胶(无血清RPMI 1640培养液1∶8稀释)平铺于Transwell小室上室，室温固化30 min，其余步骤与迁移实验相同。

1.2.5qPCR检测SNHG10与miR-154-5p表达 TRIzol法提取A549细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA。使用合成的cDNA作为模板在荧光定量PCR仪上进行扩增。反应体系(20 μL)：9.0 μL SYBR mix、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物、2.0 μL cDNA模板、8.0 μL RNase dH2O。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共40个循环；
然后72 ℃延伸1 min。2-ΔΔCt法分别计算SNHG10、miR-154-5p相对于GAPDH、U6的表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.6Western blot法检测MRP1、MCMP、Bcl-2、Bax蛋白表达 使用RIPA裂解液提取各组A549细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，取30 μg蛋白上样，进行SDS-PAGE、转膜、封闭，加入β-actin、MRP1、MCMP、Bcl-2、Bax一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，次日加羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，孵育1 h，ECL显色、拍照，分析各条带灰度值。

2.1过表达SNHG10对A549细胞增殖、迁移、侵袭、PTX敏感性的影响 pcDNA-SNHG10组A549细胞miR-154-5p水平、PTX IC50、迁移细胞数、侵袭细胞数、MRP1、MCMP及Bcl-2蛋白水平低于pcDNA-NC组(P<0.05)，SNHG10水平、细胞增殖抑制率及Bax蛋白水平高于pcDNA-NC组(P<0.05)。见表2、图1、2。

注：A为细胞迁移实验；
B为细胞侵袭实验。

表2 过表达SNHG10对A549细胞miR-154-5p水平、增殖、迁移、侵袭、PTX敏感性的影响

注：*P<0.05；
n=6。

2.2下调miR-154-5p对A549细胞增殖、迁移、侵袭、PTX敏感性的影响 anti-miR-154-5p组A549细胞miR-154-5p水平、PTX IC50值、迁移细胞数、侵袭细胞数、MRP1、MCMP及Bcl-2蛋白水平低于anti-NC组(P<0.05)，细胞增殖抑制率及Bax蛋白水平高于anti-NC组(P<0.05)。见表3及图3、4。

2.3SNHG10靶向调控miR-154-5p表达 Starbase网站预测，SNHG10与miR-154-5p存在结合位点，见图5。双荧光素酶实验显示，共转染SNHG10-WT+miR-NC的A549细胞荧光素酶活性较共转染SNHG10-WT+miR-154-5p mimics的A549细胞高(P<0.05)，见表4。

注：A为细胞迁移实验；
B为细胞侵袭实验。

表3 下调miR-154-5p对A549细胞增殖、迁移、侵袭、PTX敏感性的影响

注：*P<0.05；
n=6。

注：WT表示野生型；
MTU表示突变型。

表4 荧光素酶活性检测

2.4过表达miR-154-5p可逆转SNHG10对A549细胞增殖、迁移、侵袭、PTX敏感性的影响 miR-154-5p mimics+pcDNA-SNHG10组A549细胞miR-154-5p水平、PTX IC50、迁移细胞数、侵袭细胞数、MRP1、MCMP及Bcl-2蛋白水平高于miR-NC+pcDNA-SNHG10组(P<0.05)，细胞增殖抑制率及Bax蛋白水平低于miR-NC+pcDNA-SNHG10组(P<0.05)。见表5及图6、7。

注：A为细胞迁移实验；
B为细胞侵袭实验。

表5 过表达miR-154-5p可逆转SNHG10对A549细胞增殖、迁移、侵袭、PTX敏感性的影响

注：*表示P<0.05。

NSCLC是肺癌的主要亚型，是全球癌症相关死亡的主要原因[8]。NSCLC主要包括肺鳞状细胞癌和肺腺癌两种亚型。近年来，NSCLC靶向治疗及化疗等方面取得了一定的进展，但仍然只有不到15%的NSCLC患者能够存活5年以上[9]。PTX是第一个被确定的微管稳定剂，被认为是过去二十年化疗中最重要的进步，是使用最广泛的抗肿瘤药物之一，在多种癌症中具有广泛的活性，包括乳腺癌、子宫内膜癌、NSCLC、膀胱癌和宫颈癌[10]。临床治疗中PTX是晚期NSCLC的替代疗法，然而，内在的和获得性耐药经常出现在NSCLC治疗过程中，影响疗效[11]。为了提高PTX的化疗效果，迫切需要探索其潜在的作用机制，并制定有效的策略来克服NSCLC对PTX的耐药性。

多项研究表明，LncRNA可在不同癌症的进展中发挥关键作用，并与肿瘤转移及耐药性相关[12]。LI等[13]研究发现，LncRNA NEAT1在NSCLC PTX耐药细胞A549/PTX中显著上调，抑制NEAT1表达可逆转A549/PTX细胞的PTX抗性。YANG等[14]研究发现，LncRNA MALAT1过表达可显著增加NSCLC细胞对顺铂、吉非替尼、阿霉素和PTX等药物的化学抗性，MALAT1可通过靶向miR-197-3p调节NSCLC细胞的化学耐药性。据报道，SNHG10在多种人类癌症作为促癌基因发挥作用，SNHG10能够促进骨肉瘤的细胞增殖和侵袭[15]，且在肝细胞癌[16]和胃癌[17]中促进肿瘤发生发展。但LIANG等[5]研究结果则表明，SNHG10在NSCLC中低表达，可能发挥抑癌作用。本研究中，过表达SNHG10后，A549细胞迁移及侵袭细胞数下降，细胞增殖抑制率升高，细胞增殖蛋白MCMP、抗凋亡蛋白Bcl-2水平下降，促凋亡蛋白Bax水平升高，提示过表达SNHG10可抑制细胞增殖、迁移、侵袭，与LIANG[5]结果一致。CAO等[18]研究证实，SNHG10通过海绵化miR-1271-5p上调TRIM66，可能是前列腺癌细胞多西他赛耐药的分子机制。本研究显示，过表达SNHG10可降低A549细胞对PTX的IC50值，耐药蛋白MRP1水平下降，提示过表达SNHG10可提高A549细胞的PTX敏感性。

LncRNA可充当miRNA海绵，从而调节靶向mRNA的稳定性，还可通过抑制miRNA活性参与肿瘤耐药[19]。文献[14]表明，MALAT1可能通过靶向miR-197-3p调节NSCLC细胞的化学耐药性。文献[18]则显示，SNHG10可通过海绵化miR-1271-5p，上调靶基因TRIM66的表达，参与前列腺癌多西他赛耐药过程。为探讨SNHG10在NSCLC细胞PTX耐药性中的可能作用机制，本研究首先通过Starbase网站搜索发现，SNHG10与miR-154-5p存在互补序列，双荧光素酶实验进一步证实，SNHG10可靶向调控miR-154-5p。miR-154-5p位于人类染色体14q32上，参与各种疾病的病理生理学过程。最近的研究表明，miR-154-5p在多种癌症中作为抑制因子发挥作用，miR-154-5p在乳腺癌、结直肠癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、骨肉瘤、鼻咽癌下调[20]。本研究中，抑制miR-154-5p表达可降低A549细胞增殖、迁移及侵袭能力，提示miR-154-5p在NSCLC中发挥促癌作用，与其在多数癌症中的作用相反。推测造成这种现象的原因可能与癌症类型以及miR-154-5p下游靶基因不同有关，在后续的研究中将从其下游基因入手进行深入分析。此外，miR-154-5p过表达可增加乳腺癌细胞对阿霉素的治疗敏感性[21]。本研究结果表明，抑制miR-154-5p表达，可降低A549细胞对PTX的IC50值及MRP1水平，表明抑制miR-154-5p可提高A549细胞的PTX敏感性。进一步分析显示，过表达SNHG10可下调miR-154-5p表达，而过表达miR-154-5p可逆转过表达SNHG10对A549细胞IC50值、迁移、侵袭、增殖、MRP1、MCMP、Bcl-2、Bax蛋白的影响，提示SNHG10可通过靶向miR-154-5p提高NSCLC细胞的PTX敏感性。

有报道称，miR-154-5p可通过靶向抑制鼻咽癌中的KIF14抑制细胞侵袭和迁移[22]；
在宫颈癌中，miR-154-5p直接靶向CUL2调控癌细胞的增殖、迁移和侵袭[23]。其中，KIF14已被鉴定为多种癌症的候选癌基因，过度表达KIF14的肺肿瘤患者显示出生存率下降的趋势[24]；
KIF14是否参与miR-154-5p对NSCLC的调控作用还未可知，在未来的研究中将对此进行深入分析。

综上所述，过表达SNHG10可抑制NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭，增加NSCLC细胞对PTX的敏感性，可能通过靶向miR-154-5p发挥作用。