小分子热休克蛋白与肿瘤凋亡关系的研究进展

王怡民 李清华

桂林医学院附属医院神经内科 广西神经系统疾病临床医学研究中心 桂林医学院广西脑与认知神经科学重点实验室，桂林 541001

小分子热休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）是一类不依赖三磷酸腺苷（ATP）的分子伴侣，包括HSPB1、HSPB5、HSPB6、HSPB8等［1］。它的特征是在高度灵活可变的c端和不太保守无序的n端之间有80～100个氨基酸的保守序列，称为晶体蛋白结构域。晶体蛋白结构域对于sHSPs的二聚化和功能至关重要［2］。sHSPs 的单体分子量一般在10～42 kDa之间，但在自然状态下，它们在不同的条件下形成12～32个亚基的低聚物。电子显微镜和X射线晶体学表明，这些低聚物形成环状结构，内部空腔由对称堆积的二聚亚基所组成［3］。像其他分子伴侣一样，它们有一个高能力结合且未折叠的蛋白质和促进底物复合的功能。它们保护细胞免受蛋白质聚集的影响，但必须将容易聚集的客户蛋白释放到其他下游伴侣，以促进重新折叠［4］。与其他HSPs 相比，sHSPs底物结合和伴侣功能的机制还有待进一步研究。

凋亡是所有细胞的一种死亡形式，肿瘤细胞也包括在内。肿瘤细胞凋亡的发生表现为细胞形态学的明显变化，包括膜漂浮、核碎裂、细胞固缩和mRNA 衰变［5-6］。最后剩下的细胞被包装成凋亡小体，在胞吐的过程中被吞噬细胞迅速清除［7］。肿瘤凋亡的标志性核心是半胱氨酸蛋白酶（caspases）的激活以及达到顶峰，它介导细胞内重要蛋白质的蛋白水解裂解。而死亡细胞到达凋亡执行点的方式可以通过内在和外在2种机制来实现［8］。近年来，国内外有许多研究表示sHSPs 有可能通过凋亡途径影响肿瘤的迁移增殖等一系列表型，以及可能对肿瘤的增殖产生抑制作用，本文将以上两者关系予以综述，以期对肿瘤的治疗及研究方向给予参考。

HSP27 是sHSPs 家族中研究较多的成员，在许多信号通路中发挥着重要作用，例如肿瘤的发生、治疗抗性和抑制凋亡以及其他的通路中，和其他sHSPs 类似，它的存在也不依赖于ATP［9-10］。在一定条件下，它可以用来调节多种信号传导途径和细胞功能，这一般发生在磷酸化之后［11］。HSP27 在人类细胞中表达程度较为普遍，且在心肌、骨骼肌中高度表达［12］。HSP27 的表达在细胞生长、环境应激条件（如热诱导、氧化应激）和癌症中都会被上调［13-14］。

有研究者在A549 细胞（人肺癌细胞）的基础上，用槲皮素（HSP27 抑制剂）、KRIBB3（HSP27 磷酸化抑制剂）和SB203580 与超氧化物或细胞毒剂共同作用，以上几组都能增加caspase-9 和caspase-3 的裂解，而使用促凋亡剂处理后凋亡增加［15］。有文献指出，用pCMV6-AC-HSP27、pCMV6-AC 转染U2OS 细胞（人骨肉瘤细胞），并与Bufalin（50 nM）或不与Bufalin 孵化48 h，与对照组相比，过表达的HSP27凋亡率明显下降［16］。为了观察HSP27下调对细胞凋亡相关蛋白表达的影响：Bax、Bcl-2 和PARP1，研究者观察了光动力疗法（PDT）后KB 细胞（人口腔表皮样癌细胞）的蛋白表达水平。结果显示，HP（5 µM）处理HSP27 siRNA 细胞后，Bax、PARP 水平下降［17］。通过将HSP27 或c-FLIP 基因的siRNA 转染到人前列腺癌细胞（PC-3）中，在多梯度浓度的多沙唑嗪处理后，研究者发现，与非沉默细胞相比，TUNEL阳性细胞的数量都有所增加。而当他们同时将上述2 种基因转染时，TUNEL 阳性细胞的数量增加更明显［18］。众所周知，TUNEL阳性细胞中会出现核浓缩和核碎裂，这是细胞凋亡的特征性表现。有研究者通过Hoechst 33258 染色检测法检测细胞凋亡来验证HSP27下调对人鼻咽癌细胞（CNE1-IR 细胞）辐射的敏感性。结果显示在6 Gy 辐照1 d后，转染HSP27 反义寡核苷酸（ASO）的CNE1-IR 细胞与转染SO 的CNE1-IR 细胞相比，前者的凋亡细胞更多。此外，转染了HSP27 ASO 的CNE1-IR 细胞在辐照后的细胞比转染了SO 的CNE1-IR 细胞存活率降低［19］。以上结果均可说明，HSP27 在肿瘤凋亡中可以影响相应凋亡蛋白的表达，以及影响肿瘤细胞存活率，可以为后续研究提供更宽广的方向。

目前研究表示，HSPB5 可以保护细胞免受不利条件的影响，调节与生存和压力恢复有关的几个细胞过程，如蛋白质降解、细胞骨架稳定和细胞凋亡［20-22］。在没有压力诱导的情况下，它也可以表达。在健康成年人及生物体的发育过程中也可被检测到［23］。例如，在骨骼肌和心肌中，HSPB5的表达对于适当的肌节排列和线粒体结构以及维持被动硬度和氧化还原平衡至关重要［23］。

有文献指出，HSPB5 可以通过与半胱天冬酶-3 酶原（procaspase-3）的结合和抑制其自身蛋白裂解进而产生抗凋亡的作用，或与Bax 和Bcl-XS 结合，避免其转入线粒体，从而有利于异常细胞增殖［24-26］。HSPB5 上调后通过与Bcl-2家族成员（如caspase-3、Bax和Bcl-XS）的直接相互作用以及Akt 和Raf/MEK/ERK 通路的组成性对细胞激活负向调控凋亡过程。CRYAB还被发现通过抑制Ras激活来抑制由钙激活细胞介导的p53 依赖性细胞凋亡Raf/MEK/ERK 信号通路［27］。CRYAB还可以通过参与调节PKCalpha 和Raf/MEK/ERK 信号通路蛋白来阻断UVA 细胞凋亡［28］。由于其抗凋亡作用，其也被认为是乳腺癌中的一种癌蛋白，因为它在凋亡抵抗中的作用可以解释癌细胞的侵袭性［29］。更准确地说，磷酸化的HSPB5 与抗凋亡蛋白Bcl-2 相互作用，在抗癌药物治疗的细胞中可以增加凋亡。此外，在人脑胶质母细胞瘤中，αβ 晶体蛋白在耐凋亡的侵袭性肿瘤细胞中高表达。在U-373MG中，抑制αβ 晶体蛋白的表达可使肿瘤细胞对放线菌素D诱导的凋亡敏感［30］。

HSPB6 属于在生物体中表达普遍的sHSPs，在平滑肌、骨骼肌和心肌细胞中表达程度最高［31-36］。大鼠比目鱼肌的HSPB6表达水平也有一定程度升高［37］。HSPB6的表达有可能与热诱导关系不大，因此可能不依赖于热休克因子（HSF）-1的作用。有试验指出，把脊髓分离出去，去除神经的支配，有可能导致大鼠比目鱼肌、跖肌和长收肌中的HSPB6表达减少［34，37-39］。把大鼠的膀胱结扎掉之后，在其中也检测到HSPB6 的变化，而这种变化与前者正好相反［40］。这表明，某些生理因素和试验可以影响细胞内的HSPB6水平。

有文献报道，HSPB6 可以激活Huh-7 细胞的凋亡途径并诱导凋亡。在caspase 信号的上游，有线粒体介导的系统，可以调节凋亡途径，这其中就包括Bcl-2 家族［41］。Bcl-2 家族包括2 种与凋亡相关的蛋白，一种是促进作用，另一种与之相反。众所周知，异硫氰酸荧光素是一种常用的荧光染料，可以与磷脂酰丝氨酸结合，这种物质一般位于细胞膜内侧。在凋亡早期，这种物质可以产生异位，从而来到细胞表面。而碘化丙啶只能对中晚期的凋亡细胞产生反应。二者结合则可分辨出凋亡的时期。有文献指出，与植入LLC细胞对照组的小鼠相比，对照组、即注射了HSPB6组的肿瘤细胞上Annexin V-FITC 的结合很少。而对照组在第14 天的结合率远远高于HSPB6组［42］。以上结果说明，HSPB6 可以对LLC 肿瘤产生影响，而且这种影响一部分是通过减少细胞凋亡来实现的。在接下来的增殖实验、迁移实验以及血管生长因子基因和蛋白定量实验中，都取得了与之前实验一致的趋势。有文献报道，将野生型HSP20 cDNA 转染肝细胞癌（HCC）来源Huh-7细胞后，检测了凋亡的相关指标。结果显示高表达HSP20的Huh-7细胞与空载组相比，PARP 的裂解明显增加，而前者的裂解一般提示细胞发生了凋亡程序，以上提示HSP20 诱导caspase 级联导致细胞凋亡［43］。众所周知，Bcl-2家族蛋白是线粒体介导凋亡的关键死亡调节因子［41］。以上实验还显示，HSP20 过表达细胞中的HSP20 蛋白与BAD、Bcl-2 或Bcl-XL 蛋白没有免疫共沉淀，但与Bax 的结果却相反，说明与后者可直接作用，而与前者却没有作用。

在所有sHSPs 家族中，HSPB8（也被命名为HSP22、H11、E2IG1）近年来尤其受到关注。HSPB8 在许多组织中都有表达，在人类骨骼肌和平滑肌、心脏及大脑中表达量较高。但在人类皮肤中，HSPB8却在角质细胞中表达，角质细胞因此表现出长期的增长潜力［44］。其他的sHSPs 主要以包含其他sHSPs 伴侣的同质或异质多聚体形式存在，而HSPB8 主要以单体和二聚体的平衡混合物形式存在，这点是两者的区别［45］。HSPB8 可以诱导促凋亡和抗凋亡信号，这点是相互矛盾的，而这取决于细胞类型以及蛋白的表达水平［46］。一般情况下，在压力诱导以及细胞类型不同的情况下，HSPB8的表达程度不尽相同，且这种程度呈正相关。

有文献报道，恢复HSPB8 通过激活新的转化生长因子（TGF）-β激活的激酶1（TAK1）依赖的死亡途径可以导致黑色素瘤生长停滞和凋亡［47］。而Huh-7 细胞中HSPB8 蛋白的下调通过抑制PI3K/Akt/p70 S6激酶信号传导明显增强了TGF-α 诱导的细胞迁移，也表明HSPB8 在HCC 细胞迁移中的抑制作用［48］。有文献指出，将转染了HSPB8-siRNA1 和NC 的AGS 和BGC803 细胞进行Annexin V-FITC/7AAD 染色和流式细胞仪检测，结果表明在AGS 和BGC-803 细胞系中，HSPB8敲除对早期凋亡影响不明显，但晚期凋亡细胞的比例增加较多［49］。这表明敲除了HSPB8后，对以上细胞系的凋亡有明显影响，且跟细胞的时期有关。HSPB8 在胃癌细胞系中是一种促增殖的蛋白，它也可以帮助胃癌细胞逃避凋亡对其的影响，在这点上，HSPB8的致癌作用与大多数其他sHSPs 成员基本一致。体外下调的HSPB8 表达抑制了乳腺癌细胞的增殖，而过表达的HSPB8 则能促进乳腺癌细胞增殖生长［50］。另有文献指出，HSPB8 在黑色素瘤细胞系和原发性黑色素瘤组织中的表达水平高于正常黑色素细胞［51］。综上，根据细胞类型和条件，HSPB8可能同时显示抗凋亡和促凋亡活性。

癌症是目前威胁人类健康的其中疾病之一，且目前没有较为有效的治疗手段。在肿瘤的发生发展过程中，HSPs扮演着举足轻重的角色，尤其是sHSPs。sHSPs 参与了肿瘤细胞多种机制，如细胞增殖、分化、侵袭等。由上所述，3 种sHSPs具有一定的抗凋亡功能，研究者认为敲减sHSPs可能会增加肿瘤细胞对凋亡的敏感性，从而对肿瘤的治疗有一定的指导意义。目前关于sHSPs 与肿瘤凋亡之间仍有亟待明确的问题，例如：大部分用传统的凋亡途径解释了问题，如Bcl-2 家族蛋白、Raf/MEK/ERK 信号通路等，是否存在其他途径，如泛素化蛋白酶体途径或自噬溶酶体途径；
大部分研究者是通过基因敲减或过表达来实现对蛋白的调控，是否有其他方法来实现蛋白的过表达，抗凋亡和促凋亡的细胞系之间是否有某种联系等，这些问题都有待于进一步研究与探讨。可以预见的是，随着研究的深入，不断对上下游的机制进行探索，可能会发掘更多的联系，以对肿瘤在凋亡方面的解释更加明晰，从而提供一个在治疗上的新思路和新策略。