接触脑脊液神经元及其神经干细胞特性相关研究进展

严伟红，杨磊落，曹 亮，张 毅，皮文俊

接触脑脊液神经元(CSF-cNs)是中间神经元的一个亚群，在中央管内表现为顶端球状延伸，并将基底轴突投射发送到其他细胞。虽然CSF-cNs早在近一个多世纪前就被发现了，但其具体特征和功能才刚刚开始被揭示。最近大量研究详细阐述了CSF-cNs的特征，包括形态、分类、空间分布及特异性标志物等。随着对CSF-cNs的深入探索，现有部分研究者发现其可能是位于脊髓中央管及其周围的神经干细胞，在脊髓损伤后可能发挥很重要的作用。因此，本文对国内外关于CSF-cNs及其神经干细胞特性的相关研究进展进行综述如下。

CSF-cNs是位于脊髓中央管周围的一类独特的神经元，与脑脊液保持接触[1]。其一部分位于脊髓中央管的室管膜层及其周围脊髓实质内[2]，另一部分相对集中分布于中脑与脑桥交界处导水管周围灰质中[3]。在哺乳动物的延髓和脊髓中，CSF-cNs是双极细胞，具有单一的类球状树突突出至中央管与脑脊液接触，并有一个细薄的无髓轴突终止于前正中裂的软膜面[1]。KOLMER[4-6]和AGDUHR[7]观察并描述了大多数脊椎动物脊髓中CSF-cNs形态，而DALE等[8]将其命名为KA细胞。随后，VIGN和VIGH-TEICHMANN[9]用电子显微镜研究了CSF-cNs的特殊形态，发现CSF-cNs具有伸入中央管的树突状末端。

PARK等[10]根据CSF-cNs在斑马鱼中的位置及起源，将KA细胞分为KA "(背侧)和KA""(腹侧)2种细胞亚群。相对KA "细胞位于运动神经元前体(PMN)区域，KA""细胞主要分布于侧底板(LFP)区域[10-12]，且细胞命运图显示，所有KA "细胞均来源于PMN区域Oleg2+祖细胞，而KA""细胞来源于LFP区域Nkx2.2a+/Nkx2.2b+/Nkx2. 9+祖细胞[10]。大多数CSF-cNs在斑马鱼受精后16.5 h左右产生[13-15]。同样的，在小鼠脊髓中CSF-cNs也由2个不同的背腹区域组成[16]，其中大多数CSF-cNs来源于Nkx6+/Pax6+祖细胞，主要位于p2神经祖细胞结构域和少突胶质细胞结构域的背侧部分，而少部分CSF-cNs亚群起源于p3神经祖细胞结构域和底板之间边界的Nkx2.2+/Foxa2+前体细胞[17]。这2个CSF-cNs亚群的发育受到Pax6精确调控，且出生后因在中央管周围的位置不同，从而表现出电生理差异[11,18-19]。

尽管CSF-cNs已经被发现了一个多世纪，但因其缺乏特异性标志物，人们对它的功能了解依然十分模糊。直到2006年，HUANG等[20]首次通过实验研究确定了多囊肾病2样1通道蛋白(PKD2L1)可作为CSF-cNs的特异性标志物，PKD2L1的发现为研究CSF-cNs的细胞特性提供了基础。随后，有研究者称可以借助GATA结合蛋白2(GATA2)和GATA结合蛋白3(GATA3)等转录因子来辅助CSF-cNs的鉴定[18-21]。此外，有学者在CSF-cNs中也发现了γ-氨基丁酸(GABA)和酸敏感离子通道(ASICs)[22]。这些发现无疑对CSF-cNs的进一步研究具有重要意义。

2.1CSF-cNs和PKD2L1 PKD2L1属于瞬时电位受体家族[23-24]。PKD2L1最初被鉴定为味蕾中的酸味受体，在小鼠、斑马鱼和猕猴的脊髓脑脊液、中枢神经系统中被发现[18]。PKD2L1是一种对细胞外pH值和渗透压变化敏感的感觉传导蛋白，可感知脑脊液流量和脊髓扭转[19-20]。尽管那时脑脊液pH和渗透压的生理变化尚不清楚，但这些观察结果表明CSF-cNs可能是受脑脊液的化学和(或)机械信号调节的相互感受器。值得注意的是，PKD2L1通道在小鼠、猕猴和斑马鱼的脊髓CSF-cNs中是保守的，这些物种的脊髓CSF-cNs选择性地表达PKD2L1。目前，PKD2L1被广泛认为是CSF-cNs的一个特异性标志物，当细胞外或细胞内钙离子升高或处于低渗状态时，该通道承担了CSF-cNs中大电流的功能。PKD2L1能够产生足够的去极化以触发动作电位，从而可作为一个尖峰发生器。另外，有研究发现多囊肾病1样2通道蛋白(PKD1L2)和PKD2L1在CSF-cNs中选择性地共同表达，表明PKD1L2可能调节PKD2L1的活性及其在膜上的定位，以避免CSF-cNs的过度兴奋[25]。总之，PKD2L1的发现为探索CSF-cNs的生理功能提供了一个明确的方向[26]。

2.2CSF-cNs和GABA GABA被认为是中枢神经系统的主要抑制性神经递质[27]。然而，GABA在发育早期阶段是兴奋性的，在神经元分化的后期阶段逐渐变成抑制性。GABA在CSF-cNs中的表达首先在大鼠中被报道。此后，CSF-cNs的GABA表达在许多物种中被发现。DALE等[8,22]命名了一类CSF-cNs，它位于青蛙胚胎脊髓的外侧，通过使用抗神经递质GABA和谷氨酸脱羧酶他们报道了CSF-cNs解剖学的更多详细信息，包括轴突投射模式、发育过程中外观，以及在青蛙和斑马鱼中的分布、组织。CSF-cNs的GABA能表型，结合其在中央管周围与管腔接触的位置，成为识别CSF-cNs的主要分子标准[22]。

2.3CSF-cNs和转录因子 转录因子在CSF-cNs的生成和发展中起着关键作用。ASCL1是基本螺旋环螺旋转录因子之王，控制着中央管脊髓中CSF-cNs和上皮细胞的平衡，并在CSF-cNs的前体细胞中高度表达[28]。Nkx6.1也是一个转录因子，能使运动神经元分化，PKD2L1+CSF-cNs表达Nkx6.1[29]。Pax6是包含配对盒的转录因子成员，在小鼠中Pax6在PKD2L1+CSF-cNs细胞部分背侧亚群中表达，且在CSF-cNs神经发生过程中Pax6的表达显著下调[18]。有研究表明可联合使用转录因子Nkx6.1和Pax6作为CSF-cNs的标志[18]。此外，Nkx2.2和Foxa2是参与胚胎发育和分化的转录因子，可用于识别部分斑马鱼中的CSF-cNs[30]。在以往的研究中，CSF-cNs的鉴定基本依赖于PKD2L1的表达。然而，近期有研究发现GATA2和GATA3转录因子在CSF-cNs中有特异性表达，因其有着不同的调节网络，所以可用于鉴别不同亚群的CSF-cNs[21-31]。PETRACCA等[18]建议将PKD2L1与转录因子GATA2、GATA3联合作为CSF-cNs的识别标志，且在后来的研究中他们多次使用了这2个转录因子作为标志以识别CSF-cNs。因此，CSF-cNs的双重标志无疑会促进研究者对其未来的生物学及功能研究。

2.4CSF-cNs和ASICs 体内酸碱平衡对生物体的生存至关重要，ASICs在感知pH变化中发挥重要作用，是细胞外质子门控兴奋性阳离子通道，在3种已鉴定的ASICs亚型中，酸敏感离子通道3(ASIC3)广泛表达于感觉神经元和神经末梢，在那里机械和伤害性刺激被转化为电信号。ASIC3通道广泛存在于外周和中枢神经系统中，在中枢感觉神经元中，其作为电化学传感器参与躯体和内脏伤害感受。在外周水平，ASIC3在炎性疼痛中起重要作用，并且ASIC3还参与机械感觉及脊髓水平疼痛信号的传递和调节[32]。CSF-cNs对机械刺激和pH值降低均有反应，这种效应能够被ASIC3阻断剂消除，这表明CSF-cNs对机械刺激和pH值降低的感应是通过ASIC3通道实现的[33-34]。

3.1CSF-cNs发育起源 一般来说，B1细胞是在胚胎期第13.5天到第15天之间由放射状胶质细胞产生的[35]。有趣的是，CSF-cNs产生于胚胎期第12天至第22天，且绝大多数CSF-cNs产生于第14和15天。与其他脊髓神经元相比，CSF-cNs的生成并不局限于特定的神经上皮层，它甚至被认为是在神经源性晚期产生的[36]。在第13.5天 CSF-cNs前体细胞表达Ascl1，它控制着CSF-cNs和室管膜细胞之间的平衡。此外，CSF-cNs和神经干细胞共享多种干细胞标志物，如Nestin和Sox2。

早在2003年就有研究报道在大鼠脊髓中存在一个高度可塑性的GABA能 CSF-cNs群体，共同表达谷氨酸脱羧酶和多聚唾液酸化的神经细胞黏附分子(PSA-NCAM)，而PSA-NCAM是细胞可塑性的标志[37]。在七鳃鳗脊髓横断实验中发现脊髓损伤后中央管周围有许多新形成的神经元聚集，这种现象在脊髓横断7周后仍然存在，且据推测，这些新生神经元可能是CSF-cNs[38]。类似的现象在鳗鱼中也有报道[39]。CSF-cNs在小鼠脊髓中表达HUC/D神经元蛋白、Doublecortin和PSA-NCAM，但不表达神经元特异性核蛋白。这些未成熟神经元表现出电生理特性，从缓慢的钙离子介导反应到快速重复的钠离子峰，这表明它们处于不同的成熟阶段[1,18,25]。此外，PKD2L1+CSF-cNs还表达转录因子Nkx6.1，这是一种包含同源结构域的蛋白，可将腹侧祖细胞分化为体细胞运动神经元和中间神经元[40]。然而，CSF-cNs表达双皮质蛋白和Nkx6.1，这是2种未成熟神经元的标志物，这种表型在12个月大的动物中持续存在。表明CSF-cNs的持续成熟发生在出生后，这些CSF-cNs保持着持续的低分化状态[26]。

3.2CSF-cNs和神经干细胞池 在成年哺乳动物大脑中，神经干细胞至少存在于3个主要的生发区：海马齿状回颗粒下区、侧脑室室管膜下区和脊髓中央管小生境，越来越多的研究证实了这一点[41]。这些成熟神经干细胞在一生中不断产生功能性神经元，这一代神经干细胞被认为对嗅觉、学习和记忆等生物功能至关重要。在创伤性脑损伤等病理条件下，神经干细胞的增殖和神经发生增加，生成新的神经细胞迁移到损伤部位并替换受损神经元。根据形态学特征，脊髓中央管细胞至少可区分出3种不同的细胞类型：多纤毛型室管膜细胞，基底突短，与邻近神经组织接触；
单纤毛型室管膜细胞，呈典型的放射状胶质形态；
CSF-cNs，直接接触脑脊液的双极细胞，这些细胞的一侧突出与脑脊液连接，而另一侧与脊髓实质连接，从而形成“脑-脑脊液屏障”。虽然室管膜细胞曾被认为是脊髓中的神经干细胞[42]，然而单细胞RNA-seq显示室管膜细胞富集的纤毛相关基因共享几个干细胞相关基因。此外，在体内和体外暴露于神经干细胞或祖细胞刺激环境下的室管膜细胞不表现出任何潜在的神经干细胞功能[43]。值得注意的是，CSF-cNs不仅存在于哺乳动物的中缝背核、下丘脑和大脑的其他区域，而且在脊髓中央管中强烈富集[44]。

3.3CSF-cNs神经干细胞潜能和脊髓损伤修复 众所周知，脊髓损伤是神经外科领域最具破坏性的疾病之一。脊髓损伤患者通常会失去自理能力，在生理和心理上承受着巨大的痛苦，并给家庭和社会带来沉重负担。即使有最好的药物、手术和康复治疗，许多患者仍然不得不面对严重的神经后遗症。20世纪90年代初，在包括人类在内的哺乳动物中发现了成体神经干细胞，这为通过刺激这些细胞进行自我再生来治疗中枢神经系统疾病提供了新的可能性[42,45]。脊髓损伤促进了神经球形成的增加，使神经干细胞的数量显著增加，神经干细胞可以为脊髓损伤微环境提供轴突营养支持，并可增强血管形成、改变炎症反应和防止囊性变化，从而促进运动功能的恢复[46]。然而，脊髓中央管内神经干细胞的身份仍有争议。先前的一项研究发现，神经干细胞位于室管膜细胞中，故可以作为脊髓损伤后的细胞移植[47]。然而，另一项研究未能证实室管膜细胞具有神经干细胞功能[43]。因此，脊髓中央管内神经干细胞的鉴定对于脊髓损伤的治疗至关重要。相比之下，CSF-cNs的潜在神经干细胞特性将为脊髓损伤患者带来新的治疗曙光，可以想象CSF-cNs将在脊髓损伤的治疗中发挥积极作用。有研究发现，在脊髓损伤动物模型中，经侧脑室注射外源性细胞生长因子可以激活内源性神经干细胞发生增殖和迁移，促进损伤脊髓组织的修复[48]。有研究人员通过将霍乱毒素亚单位B-辣根过氧化物酶复合体注入大鼠侧脑室以标记远位触液神经元，并注入霍乱毒素B与皂苷耦联以破坏这些细胞，在注射第14天建立脊髓损伤模型，结果发现破坏CSF-cNs后会使脊髓损伤大鼠的内源性神经前体细胞群体数量减少，同时延长了术后神经功能恢复的时间[49]。由此推测CSF-cNs可能是内源性神经前体细胞的来源之一，并可能参与脊髓损伤后的神经恢复。WANG等[50]通过流式细胞术分离纯化CSF-cNs，分别贴壁培养和悬浮培养，检测神经干细胞标志物表达。免疫荧光染色表明，由PKD2L1+CSF-cNs形成的神经球表达神经干细胞标志物巢蛋白、Sox2和GFAP，并且这些神经球还具有通过体外培养分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。这也表明CSF-cNs是未成熟的神经元细胞，具有神经干细胞的特性，可以增殖和分化为其他神经细胞[46]。因此，深入研究CSF-cNs增殖和分化的分子机制将有助于开发CSF-cNs治疗脊髓损伤的潜力。

目前，专门研究CSF-cNs的科学文献越来越多，突出了这一细胞群在治疗脊髓疾病中的关键作用。其与脑脊液密切接触的性质使得针对性的鞘内治疗成为一种可行的选择。虽然CSF-cNs的研究在发现特定标志物PKD2L1后进展迅速，但CSF-cNs在体外表现出的神经干细胞特性机制仍不清楚，现在CSF-cNs可分为2个具有不同特性的群体，哪一个CSF-cNs群体拥有神经干细胞特性,CSF-cNs在脊髓损伤状态下究竟如何转化为神经干细胞，又如何进行增殖并分化为其他神经细胞，增殖和分化的神经细胞如何到达损伤部位，以及修复损伤部位的机制仍不清楚，未来需继续关注促进CSF-cNs在脊髓损伤时的激活和分化的相关分子机制或物理因素等的探索，并应致力于进一步定义脊髓损伤后该细胞群的作用。