粪便SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测对结直肠癌及癌前病变的诊断效能分析

伍红英 方慧祺 邓燕 何水珍

结直肠癌是一种来源于大肠上皮的癌症，为临床常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病机制尚不明确，可能为饮食、环境、生活方式、遗传、化学致癌物质及寄生虫等多种因素共同作用的结果[1]。2020年我国癌症统计数据显示，结直肠癌发病率居全部恶性肿瘤第2 位，死亡率位居第5 位，且大部分结直肠癌被确诊时已为中晚期，预后较差，死亡率较高[2]。癌及癌前病变的早期筛查是防治癌症、降低癌症发生率和死亡率的重要环节，60%～80%的结直肠癌是由“腺瘤-癌”途径发展而来，早期筛查、及早干预可将患者存活率提高至75%～90%[3]。结直肠镜为结直肠癌早期筛查的常用方法之一，也是结直肠癌诊断的“金标准”，然而其为侵入性操作，具有出血、肠穿孔、感染等风险，且存在一定的漏检率，而其他常见筛查方法如粪便潜血试验（Fecal occult blood test，FOBT）、血清学检查、结直肠CT 等同样存在敏感度、特异性不高，侵入性操作而导致患者依从性较差，易受食物、药物的影响等缺陷，故在结直肠癌早期筛查和鉴别诊断中应用受限[4]，因此，探寻适宜于普查的早期筛查手段，对于降低结直肠癌发病率和死亡率、提高其治愈率具有至关重要的意义。既往研究已证实，基因甲基化过程是一种伴随众多恶性肿瘤发生发展的早期事件，在肿瘤筛查方面具有良好的应用前景[5，6]。研究表明[7]，当DNA 修复基因甲基化时可沉默抑癌基因的表达，抑癌基因突变与结直肠癌的发生发展密切相关，因此检测相关基因的甲基化状态可用于结直肠病变筛查。本研究通过检测不同人群粪便中硫酸类肝素蛋白多糖（Syndecan 2，SDC2）和组织因子途径抑制物2（Tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）基因的甲基化状态，探究其对结直肠癌及癌前病变的诊断效能，为临床早期筛查、及早诊治提供一定的帮助。

1.1 一般资料前瞻性纳入2020年5月～2021年4月于我院消化内科门诊及住院就诊的45 例结直肠病变患者作为研究对象，另纳入同期于我院行体格检查的健康者21 例作为对照组。所有受试者均在肠镜检查或手术前留取粪便样本，保存于-80℃冰箱中。

经结直肠镜和术后病理学检查，45 例结直肠病变患者中确诊结直肠癌25 例，结直肠腺瘤20 例。结直肠癌诊断参考2020 版《中国结直肠癌诊疗规范》[8]中的相关诊断标准，并参照美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）中的分期标准[9]，分为Ⅰ期4 例、Ⅱ期10 例、Ⅲ期7例和Ⅳ期4 例。结直肠癌组男17 例，女8 例，年龄36～72 岁，平均（52.61±5.18）岁；
结直肠腺瘤组男10 例，女10 例，年龄34～70 岁，平均（52.23±5.54）岁；
对照组男11 例，女10 例，年龄33～73 岁，平均（53.14±5.98）岁。三组受试者年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有受试者对本研究均知晓并签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准纳入标准：①年龄25～75 岁；
②除结直肠癌外无其他肿瘤；
③入组前未接受过放化疗；
④收集粪便前5d 内未行结肠镜、灌肠、消化道钡餐等诊疗操作；
⑤依据Bristol 粪便分类法，收集粪便要求第1 型至第5 型，且量＞100g。

排除标准：①有结直肠手术既往史、结直肠肿瘤家族史者；
②有溃疡性结肠炎、克罗恩病等炎症性肠病史者；
③合并全身急慢性感染性疾病、精神疾病、其他严重器质性病变者；
④有肠镜检查禁忌证者；
⑤妊娠或哺乳期女性。

1.3 方法本研究相关实验由厦门博创盛世生物技术有限公司、厦门艾德生物医药技术股份有限公司协助完成。

1.3.1 粪便DNA 提取 每例受试者取约0.2g 粪便，使用粪便基因组DNA 提取试剂盒（Solarbio 公司）提取总DNA，采用分光光度计对DNA 进行纯度检测（A260/A280），选取检测合格的DNA 置于-20℃冰箱保存，初检不合格者再次进行DNA 提取。

1.3.2 DNA 重亚硫酸盐修饰和纯化 使用重亚硫酸盐DNA 甲基化试剂盒（QIAGEN 公司）进行DNA重亚硫酸盐修饰和纯化，产物置于-20℃冰箱保存。

1.3.3 SDC2、TFPI2 基因甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）反应 取引物F 和R 各1μl，2μl DNA 模板，4μl dNTP，1μl Ex Taq，5μl 10xEx Taq E buffer，用ddH2O 补至50μl。PCR 扩增程序：95 ℃预变性5min、95 ℃变性30s、60 ℃退火30s、72℃延伸30s，共循环35 次，再72℃延伸10min，4℃保存备用。引物序列见表1。以3%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，后进行凝胶成像。图像中M 代表甲基化特异性扩增产物，U 代表非甲基化引物特异性扩增产物，产物大小约100bp，Marker：天根公司DL2000 DNA Marker。检测MSP 扩增产物，如果用引物M 扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；
若用引物U 扩增出片段，则说明检测位点不存在甲基化；
若两对引物均能得到阳性PCR 产物，则说明该片段部分甲基化。

表1 引物序列

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。分别绘制SDC2 和TFPI2 基因甲基化单项检测及联合检测对结直肠癌及结直肠腺瘤诊断的受试者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲线，判定各指标的预测效能，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2.1SDC2 基因甲基化检测结果结直肠癌组与结直肠腺瘤组相比，SDC2 基因甲基化差异无统计学意义（χ2=0.103，P=0.748）；
结直肠癌组与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=14.764，P＜0.001）；
结直肠腺瘤组与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=15.251，P＜0.001），见图1～3 及表2。

图1 结直肠癌组粪便SDC2 基因甲基化状态

图2 结直肠腺瘤组粪便SDC2 基因甲基化状态

图3 对照组粪便SDC2 基因甲基化状态

2.2 TFPI2 基因甲基化检测结果结直肠癌组与结直肠腺瘤组比较，TFPI2 基因甲基化差异无统计学意义（χ2=0.640，P=0.423）；
结直肠癌组与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=7.701，P=0.007）；
结直肠腺瘤组与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=10.443，P=0.001），见图4～6及表2。

图4 结直肠癌组粪便TFPI2 基因甲基化状态

图5 结直肠腺瘤组粪便TFPI2 基因甲基化状态

图6 对照组粪便TFPI2 基因甲基化状态

表2 各组SDC2 基因和TFPI2 基因甲基化检测结果比较[n（%）]

2.3 SDC2 和TFPI2 基因甲基化对结直肠癌的诊断效能分别绘制SDC2 基因甲基化和TFPI2 基因甲基化单项检测及联合检测对结直肠癌诊断的ROC曲线，见图7。SDC2 基因甲基化对结直肠癌诊断的ROC 曲线下面积为0.744[95%CI（0.624～0.863）]，敏感度为71.61%，特异性为73.21%；
TFPI2 基因甲基化对结直肠癌诊断的ROC 曲线下面积为0.751[95%CI（0.631～0.879）]，敏感度为73.71%，特异性为71.06%；
SDC2 和TFPI2 基因甲基化联合检测对结直肠癌诊断的ROC 曲线下面积为0.913[95%CI（0.869～0.956）]，敏感度为81.37%，特异性为78.66%，高于各指标单项检测的预测效能。

图7 SDC2 和TFPI2 基因甲基化单项和联合检测诊断结直肠癌的ROC 曲线

2.4 SDC2 和TFPI2 基因甲基化对结直肠腺瘤的诊断效能分别绘制SDC2 基因甲基化和TFPI2 基因甲基化单项检测及联合检测诊断结直肠腺瘤的ROC曲线，见图8。SDC2 基因甲基化诊断结直肠腺瘤的ROC 曲线下面积为0.713[95%CI（0.592～0.831）]，敏感度为66.31%，特异性为67.75%；
TFPI2 基因甲基化诊断结直肠腺瘤的ROC 曲线下面积为0.721[95%CI（0.598～0.847）]，敏感度为59.89%，特异性为70.40%；
SDC2 和TFPI2 基因甲基化联合检测诊断结直肠腺瘤的ROC 曲线下面积为0.878[95%CI（0.833～0.921）]，敏感度为73.38%，特异性为81.34%，高于各指标单项检测的预测效能。

图8 SDC2 和TFPI2 基因甲基化单项和联合检测诊断结直肠腺瘤的ROC 曲线

结直肠癌是一种大肠黏膜上皮由于饮食、环境、遗传或生活方式等多种因素的作用而发生的恶性病变，是全球范围内第三大恶性肿瘤，在我国，随着人们生活习惯和饮食结构的改变，结直肠癌发病率和死亡率呈逐年上升趋势[10]。结直肠癌进展缓慢，大部分结直肠癌来源于腺瘤，由腺瘤发展至结直肠癌通常需3～10年时间[11]，若在此期间实现一级预防、二级定期筛查、三级治疗，早期发现、及早干预，可显著提高患者的生存率。然而，结直肠癌早期并无明显临床症状，仅约5%的患者可在早期确诊，绝大多数患者确诊时已为中晚期，预后较差、死亡率高[6]，因此，以切实有效的筛查方式提高早期检出率是降低结直肠癌发病率和死亡率的关键。目前临床诊断结直肠癌的方法主要有血清学指标、结构性检查和基于粪便检查等。血清学指标包括血清癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原19-9（Carbohydrate antigens 19-9，CA19-9）等，为临床辅助诊断结直肠癌及判断预后等常见指标，然而由于其敏感度和特异性不高，对于早期病变诊断价值不大。结构性检查包括结直肠镜、乙状结肠镜、CT 结肠成像、结肠气钡双重造影等。结直肠镜作为结直肠癌鉴别诊断的“金标准”，其结果准确可靠，且可在检查的同时切除病灶，具有诊断和治疗的双重价值，然而其同时存在侵入性和肠穿孔风险，患者依从性较差，难以广泛用于早期普查；
CT 结肠成像虽属无创检查，但敏感度与病灶大小有关，对于直径＜1cm 的病灶敏感度较低，易漏检，且存在辐射暴露风险；
结肠气钡双重造影需大量的肠道准备工作，对腺瘤的敏感性较低，并且同样存在辐射暴露风险，限制了其应用。粪便检查包括FOBT、粪便DNA 检测等。FOBT 虽在我国已广泛用于结直肠病变的早期筛查，然而其敏感度和特异性均不高，且易受食物、药物等影响，导致结果不稳定，此外，根据病变部位的不同，可能需要重复筛查或结合结直肠镜进一步诊断；
粪便DNA 检测的标本前处理较为繁琐，不适于大范围人群的早期筛查[12]。因此，探寻与结直肠癌及癌前病变相关的高敏感度、高特异性的筛查方案成为目前亟待解决的难题。

近年来越来越多的研究证实，游离DNA 中某些特定基因的甲基化状态为肿瘤发生发展进程中的早期事件之一，可作为肺腺癌、食管癌、结肠癌等癌症及癌前病变早期筛查的重要生物学标志物[13，14]。结直肠细胞增殖更新速度较快，而结直肠癌的黏膜脱落细胞较正常更多，因此分析粪便脱落癌细胞及特定游离DNA 的甲基化状态可作为一种无创、高检出率的结直肠病变潜在筛查手段。SDC2 属于转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）通路相关基因，为I 型跨膜硫酸肝素蛋白聚糖，参与细胞增殖、分化、迁移及免疫监控等过程。SDC2 可由肿瘤细胞合成释放，并通过相关信号转导通路在肿瘤细胞侵袭转移中发挥重要作用。研究表明[15]，肿瘤组织中SDC2 基因启动子区域发生异常甲基化，其甲基化水平远高于相邻非肿瘤组织，故SDC2 基因甲基化状态可作为结直肠癌早期筛查的标志物之一。在本研究中，结直肠癌组和结直肠腺瘤组患者SDC2 基因甲基化阳性水平均显著高于对照组，提示SDC2 基因甲基化可能与结直肠病变过程有关。龚志贇等[16]研究亦显示，结直肠癌的发生发展进程中伴随SDC2 基因甲基化的发生，粪便SDC2 基因甲基化检测可作为一种安全、无创、高效的结直肠癌筛查手段，有助于准确评估结直肠病变的进展。在结直肠病变过程中，SDC2参与调节细胞与肿瘤微环境之间的相互作用，活化基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP），分解细胞外基质（Extracellular matrix，ECM），同时参与间质-上皮转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）等生物学进程，促进肿瘤细胞的增殖、分化和迁移，因而与结直肠癌及癌前病变关系密切。

TFPI2 基因是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，广泛分布于人体各个组织器官中，定位于染色体7q22上，可抑制纤溶酶、胰蛋白酶等蛋白酶的活化，并直接参与调控ECM 的再建过程，对于细胞结构的完整性至关重要。既往研究发现[17]，包括胃癌、食管癌、结直肠癌等在内的多种恶性肿瘤患者体内均存在TFPI2 基因异常甲基化的现象。李海军等[18]研究显示，在结直肠癌及进展期腺瘤患者中TFPI2 基因甲基化的检出率分别为88.6%、68.6%，显著高于正常健康人群。本研究结果同样显示，结直肠癌组和结直肠腺瘤组患者TFPI2 基因甲基化阳性水平均显著高于对照组，提示TFPI2 基因的甲基化可能与结直肠病变过程有关，粪便TFPI2 基因甲基化状态可作为早期筛查结直肠癌及癌前病变的有效指标之一。

本研究进一步将SDC2 和TFPI2 基因甲基化纳入ROC 曲线分析，结果显示，SDC2 基因甲基化对结直肠癌和结直肠腺瘤诊断的ROC 曲线下面积分别为0.744[95%CI（0.624～0.863）]和0.713[95%CI（0.592～0.831）]，敏感度分为71.61%和66.31%，特异性分别为73.21%和67.75%，对结直肠腺瘤的诊断效果不甚理想。TFPI2 基因甲基化对结直肠癌和结直肠腺瘤诊断的ROC 曲线下面积分别为0.751[95%CI（0.631～0.879）]和0.721[95%CI（0.598～0.847）]，敏感度分为73.71%和59.89%，特异性分别为71.06%和70.40%，诊断效果仍不理想。临床实践证实，多指标联合检测可相互补充，提高诊断效能。本研究进一步将SDC2 和TFPI2 基因甲基化联合检测，结果显示，SDC2 和TFPI2 基因甲基化联合检测对结直肠癌和结直肠腺瘤诊断的ROC 曲线下面积分别为0.913[95%CI（0.869～0.956）]和0.878[95%CI（0.833～0.921）]，敏感度分别为81.37%和73.38%，特异性分别为78.66%和81.34%，显著高于SDC2 或TFPI2单项检测，大大提高了对结直肠癌和结直肠腺瘤的诊断效能，有助于避免临床出现误诊、漏诊。

综上所述，SDC2 和TFPI2 基因甲基化检测为一种非侵入性的检测手段，可作为临床诊断结直肠癌和结直肠腺瘤的重要生物学指标，且两者联合检测的诊断效能更高，可为临床早期筛查结直肠癌和癌前病变、及早干预、改善预后提供一定的帮助。