牦牛源产气荚膜梭菌青海分离株的生物学特性

李宇鹏 , 吴 丹 , 罗润波 , 宋仁德 , 格桑卓玛 , 白 吉 , 索朗斯珠

(1. 西藏农牧学院动物科学学院 ， 西藏 林芝 860000 ；

2. 青海玉树藏族自治州畜牧兽医工作站 ， 青海 玉树 815099 ；

3. 西藏自治区动物疫病预防控制中心 ， 西藏 拉萨 850014)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)又称魏氏梭菌，兼性厌氧，为可产生芽孢的革兰阳性大杆菌，广泛分布于自然界中，是一种重要的人兽共患的条件致病菌[1]；
根据其产生的致死性毒素α、β、ε、ι毒素可将其分为A、B、C、D和E共5个毒素型[2]。其中C型产气荚膜梭菌主要产生α和β毒素，可以引发人和禽类的坏死性肠炎、初生小牛和羔羊等反刍动物的肠毒血症、羊猝疽和仔猪红痢等多种严重疾病，对养殖业的发展产生较大的危害。据报道，产气荚膜梭菌可引起牦牛猝死综合征，主要的临床特征有牛舌脱垂、肛门外翻，病理剖检可见肺败血症、肠淤血和肠出血等症状[3]。本试验通过对牦牛源产气荚膜梭菌生物特性进行研究，为牦牛源产气荚膜梭菌后续研究和防治等方面提供一定的参考。

1.1 菌株 由西藏农牧学院预防兽医实验室从青海玉树地区牦牛粪样中分离保存的1株牦牛源产气荚膜梭菌，命名为qinghai-12。

1.2 主要试剂和仪器 梭菌增菌液体培养基、7%羊血琼脂培养基基础，均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；
无菌脱纤维绵羊血，购自北京索莱宝科技有限公司；
细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；
最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)试纸，购自意大利Liofilchem公司；
Trans 2K DNA Marker、核酸染料GelStain(10 000×)，均购自北京全式金生物技术有限公司。

PCR仪由Applied Biosystems公司生产；
电泳仪、凝胶成像系统，均由美国Bio-Rad生产；
高速离心机由德国Eppendorf生产；
恒温恒湿培养箱由上海博讯实业有限公司生产；
UV-1800PC型紫外可见分光光度计由上海美谱达仪器有限公司生产。

1.3 菌株复苏培养与观察 将冻存于-80 ℃的牦牛源产气荚膜梭菌缓慢梯度升温解冻，三区划线法接种于无菌血琼脂平板，41 ℃恒温厌氧培养18～24 h。随后将单菌落接种至梭菌增菌液体培养基中，41 ℃恒温厌氧增菌培养16～18 h。革兰染色后用光学显微镜观察。

1.4 生化鉴定 根据《伯杰细菌鉴定手册》[4]，利用8种(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、吲哚、乳糖、脂酶、卵磷脂酶、酪蛋白)细菌微量生化管鉴定产气荚膜梭菌的基本生化特性。根据陆承平[5]推荐方法，取对数生长期的梭菌增菌液体培养基1 mL接种于适量无菌石蕊牛奶液体培养基，在45～47 ℃水浴2 h后，每隔1 h观察有无“汹涌发酵”现象，此特性为鉴定产气荚膜梭菌最为突出的生化特性。

1.5 PCR鉴定

1.5.1 16S rRNA PCR扩增 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取牦牛源产气荚膜梭菌全基因组DNA，-20 ℃冷冻保存备用。根据参考文献[6]合成细菌通用16S rRNA引物，F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。16S rRNA PCR反应体系(50 μL)：上、下游引物各1 μL，2×TaqMix酶 25 μL，模板2 μL，去离子水 21 μL；
PCR反应程序：94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；
72 ℃ 终延伸10 min，扩增条带大小为1 456 bp。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后，委托擎科生物科技有限公司进行测序并上传至NCBI进行序列比对。

1.5.2 多重PCR分型 根据参考文献[7]合成产气荚膜梭菌分型引物(表1)。多重分型PCR体系(50 μL)：上、下游引物(共4对)各1 μL，2×TaqMix酶 25 μL，模板2 μL，去离子水15 μL；
PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；
72 ℃终延伸5 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer information

1.6 生长曲线测定 参照祖若夫等[8]介绍的振荡比浊法(Dλ法)，将1.3中制备好的增菌液按体积分数1%接种于300 mL梭菌增菌液体培养基，振荡混匀后均分至15支试管作为试验组，同时分装15支无菌梭菌增菌液试管作为空白对照组，石蜡液封，置于41 ℃恒温培养箱中持续培养。每隔2 h取出1支试验组试管和1支空白对照组试管，以空白对照组进行调零，利用UV-1800PC型紫外可见分光光度计测定培养液OD600 nm值，每个时间点重复测量3次，取平均值，连续测量24 h。以OD600 nm值为纵坐标、培养时间为横坐标，利用Microsoft Excel 2019软件绘制出牦牛源产气荚膜梭菌的生长曲线。

1.7 外毒素含量测定 根据单雪梅等[9]介绍方法，在1.6中测定OD600 nm值时，同时吸取适量菌液，12 000 r/min离心10 min，用0.22 μm细菌滤器过滤，制得外毒素粗提取液。分别测定OD280 nm和OD260 nm值，根据蛋白浓度经验公式计算不同培养时间点培养液的外毒素蛋白质含量(ρ)。

ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm

1.8 同源性分析 将测得的牦牛源产气荚膜梭菌16S rRNA序列与NCBI中GenBank数据库进行比对，在对比结果中选取来自亚洲地区且相似度较高的动物菌株序列，下载其序列后利用MEGA 6.0 软件构建系统发育树。

1.9 MIC测定 挑取单菌落接种于梭菌增菌液体培养基中，待菌液浓度生长至0.5个麦氏浊度(OD600 nm：0.8～1.3)，用稀释涂布平板法均匀涂布于MH培养基上，采用E-test法[10]测定牦牛源产气荚膜梭菌对8种常用抗菌药物(头孢噻肟、青霉素、复方新诺明、氨苄西林、四环素、多黏菌素B、红霉素、庆大霉素)的MIC。MIC纸条环尖所对应纸条上的数值就是对应抗菌药对细菌的最低抑菌浓度，根据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的《抗菌药物敏感性试验标准》对测定结果进行判定[11]。

2.1 牦牛源产气荚膜梭菌生长情况观察 复苏菌株在血琼脂平板上生长为表面光滑、半透明、圆屋顶样菌落并产生双溶血环(图1)；
在梭菌增菌培养基中生长后培养基液体由透亮的黄色变浑浊；
革兰染色镜检显示，牦牛源产气荚膜梭菌为革兰阳性大杆菌，菌体呈直杆状，两端钝圆，常单在或成双排列(图2)。

图1 牦牛源产气荚膜梭菌在血平皿上的生长情况Fig.1 Growth of Clostridium perfringens from yak on blood plate

图2 牦牛源产气荚膜梭菌革兰染色镜检 (1 000×)Fig.2 Gram staining microscopic examination of Clostridium perfringens from yak (1 000×)

2.2 生化鉴定 牦牛源产气荚膜梭菌生化鉴定结果见表2。该菌株在葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、卵磷脂酶、乳糖、酪蛋白生化管中呈阳性反应；
在脂酶和吲哚生化管中呈阴性反应。该菌株在石蕊牛奶中牛乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，上升到培养基表面，且能发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“汹涌发酵”现象。牛乳发酵试验结果符合产气荚膜梭菌基本生化特征。

表2 牦牛源产气荚膜梭菌生化鉴定Table 2 Biochemical identification of Clostridium perfringens from yak

2.3 PCR鉴定 PCR产物凝胶电泳结果见图3，16S rRNA PCR产物在约1 456 bp处出现条带，测序比对结果确定其为产气荚膜梭菌；
毒力分型PCR产物在196 bp和325 bp处出现条带，检测到β和α毒素，与C型产气荚膜梭菌毒素相符合，可确定菌株qinghai-12为牦牛源C型产气荚膜梭菌。

图3 16S rRNA(A)和毒力分型(B)的PCR扩增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA (A) and virulence typing (B)M：Trans 2K DNA Marker；

-：阴性对照；

1：菌株qinghai-12M:Trans 2K DNA Marker; -：Negative control; 1:Strain qinghai-12

2.4 生长曲线测定 牦牛源C型产气荚膜梭菌生长曲线见图4。该菌株在接种后0～4 h内处于迟缓期；
4～8 h处于对数生长期；
8～24 h为生长平衡的稳定期；
在测定期间内未测量到衰亡期。

图4 牦牛源C型产气荚膜梭菌生长曲线Fig.4 Growth curve of Clostridium perfringens type C from yak

2.5 外毒素含量测定 牦牛源C型产气荚膜梭菌不同时间点外毒素蛋白含量见表3，在培养10 h后，该菌株所产毒素的蛋白质含量达4.173 mg/mL，且随着时间的推移蛋白质含量持续增长。结果表明，牦牛源C型产气荚膜梭菌所产外毒素蛋白质在10 h时达到最佳产毒时间，含量达4.173 mg/mL。

表3 牦牛源C型产气荚膜梭菌毒素蛋白含量Table 3 Toxin protein content of Clostridium perfringens type C from yak

2.6 同源性分析 GenBank中公布的其他产气荚膜梭菌参考株序列与该菌株序列构建的系统进化发育树见图5，该菌株与北京人源(GenBank登录号：KP944154.1)、安多牦牛源(GenBank登录号：MN960262.1)、美国猪源(GenBank登录号：JQ607422.1)、华东兔源(GenBank登录号：KX986316.1)产气荚膜梭菌具有较近的亲缘性；
与中国野猪源(GenBank登录号：KX094441.1)产气荚膜梭菌具有较远的亲缘性。

图5 牦牛源C型产气荚膜梭菌 16S rRNA遗传进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on 16S rRNA of Clostridium perfringens type C from yak▲:本试验分离菌株▲：Strain isolated in this study

2.7 MIC测定 MIC测定结果见表4，牦牛源C型产气荚膜梭菌对头孢噻肟、氨苄西林、四环素、青霉素表现为敏感，对红霉素表现为中度敏感，对庆大霉素、复方新诺明、多黏菌素B表现不敏感。

表4 牦牛源C型产气荚膜梭菌 MIC测量结果Table 4 MIC measurement results of Clostridium perfringens type C from yak

生化试验是利用生物化学的方法测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件进而鉴别细菌的试验[5]。本试验中所用牦牛源产气荚膜梭菌qinghai-12的生化鉴定结果与张瑾瑜[12]鉴定结果相同，均符合产气荚膜梭菌生化特征。

生长曲线是指以微生物生长量为纵坐标，培养时间为横坐标所绘制的曲线；
常用的微生物生长量的测定方法有对微生物数量、重量及群体生理指标的测定[13]。本试验选用数量测定中的比浊法，该方法可连续测定以获得即时数据。本试验结果显示，牦牛源C型产气荚膜梭菌qinghai-12在接种后的0～4 h内处于迟缓期，4～8 h处于对数生长期，8～24 h为生长平衡的稳定期，在测定期间内未测量到衰亡期。该结果与单雪梅等[9]和王开功等[14]测量的生长曲线结果不同，其原因可能是试验方案的不同和菌株宿主来源不同。另外，本试验未能测得衰亡期可能是因为生长后期死菌对菌液浑浊度产生影响，为了更准确地测定活菌的数量，应配合平板菌落计数法来对衰亡期菌落数进行校正。

由于蛋白质组成中常有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，且该类氨基酸在280 nm的紫外光处有最大吸收峰[15]，故可根据280 nm处的吸光度大小来测量蛋白的含量。另外培养液中还存在核酸等成分，其最大吸收峰在260 nm，故可通过经验公式ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm计算蛋白浓度，排除核酸的影响。本试验利用该方法测得牦牛源C型产气荚膜梭菌qinghai-12的最佳产毒时间是10 h，此时蛋白质含量达4.173 mg/mL，且随着时间的推移蛋白质含量持续增长。该结果与单雪梅等[9]测量的D 型产气荚膜梭菌的最佳产毒时间为10 h基本一致,与王开功等[14]研究的 A 型产气荚膜梭菌所产毒素的最佳时间8 h有所差异，可能同样是与产气荚膜梭菌的宿主和毒素型有关。

MIC是测量抗菌药物的抗菌活性大小的指标之一，指在体外培养细菌18～24 h后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度，可以直观地了解病原菌的耐药性。本试验对头孢噻肟、氨苄西林、四环素、青霉素、红霉素、庆大霉素、多黏菌素B、复方新诺明8种常见抗菌药进行MIC测定，结果显示：牦牛源C型产气荚膜梭菌qinghai-12对头孢噻肟、氨苄西林、四环素、青霉素表现为敏感，对红霉素表现为中度敏感，对庆大霉素、复方新诺明、多黏菌素B表现不敏感。依据牦牛源C型产气荚膜梭菌qinghai-12来源地为青海，分析该地区可能存在庆大霉素、复方新诺明和多黏菌素B的滥用情况，推荐该地区疑似该菌感染动物优先选用头孢噻肟、氨苄西林、四环素、青霉素类药物，对红霉素的使用需慎重，必要时交叉用药，避免耐药性的产生。

综上所述，本试验复苏菌株为牦牛源C型产气荚膜梭菌，其生长特性符合梭菌生长规律，在梭菌增菌培养基中培养10 h达到最佳产毒时间，且对庆大霉素、复方新诺明和多黏菌素B耐药，对今后牦牛源产气荚膜梭菌后续研究及防治等方面具有一定的指导意义。