羊布鲁菌BtpA和BtpB基因缺失突变载体的构建及生物信息学分析

乔连江，张 萍，周玉成，杨 森，杨艳玲

（中国农业科学院特产研究所，长春 130000）

布鲁菌病（简称“布病”）是由布鲁菌属（Brucellaspp.）引起的一种严重人畜共患传染病，被列为我国法定传染病中乙类传染病之首[1]。该菌为一种典型的胞内寄生菌，其主要寄生于宿主的单核巨噬细胞中，可引起动物和人持续性感染[2]。近年来，随着我国畜牧业的迅猛发展，动物布病发病率极速攀升，并且人间布病的感染率也达到了历史新高[3]，严重影响了我国畜牧业健康发展，也给公共卫生安全带来了重大隐患。

在布鲁菌（Brucella）诸多毒力因子中，由virB操纵子所编码Ⅳ型分泌系统（T4SS）是一种关键毒力因子[4]。该系统可跨越细胞膜建立一个转运通道，通过一个类似鞭毛样结构与靶细胞接和，使分泌的效应蛋白到达靶细胞，从而帮助布鲁菌快速适应胞内环境并得以存活。据报道[5]，现已鉴定出布鲁菌T4SS效应蛋白约15种，初步证实了这些效应蛋白被分泌到宿主细胞后，在调控布鲁菌胞内生存、复制方面发挥着重要作用。其中，BtpA和BtpB作为重要的分泌效应蛋白，在布鲁菌感染早期可抑制免疫监视系统、干扰细胞的功能[6]。但是，对于BtpA和BtpB是如何精巧的调节宿主免疫反应的机制还不清楚。为此，本研究以布鲁菌16M基因组为模板，成功构建了布鲁菌BtpA和BtpB基因缺失重组载体。同时，利用分子生物信息学软件对BtpA和BtpB基因的种属间同源性、信号肽、二级结构以及B细胞表位进行预测，为下一步研制布鲁菌诊断试剂和疫苗奠定数据基础。

1.1 实验材料与仪器羊布鲁菌16M（Brucella melitensis16M）为军事兽医研究所保藏惠赠；
大肠埃希菌E. coliDH5α感受态细胞购自TaKaRa公司；
自杀质粒PBK-CMV-SacB由军事兽医研究所惠赠；
TSA和TSB培养基购自SIGMA公司；
胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PrimeSTAR®HS DNA Polymerase和2×In-Fusion HD Cloning Kit购自TaKaRa公司；
DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；
硫酸卡那霉素（Kan）购自上海生工生物工程（上海）科技有限公司；
限制性内切酶SmaⅠ购自NEB公司。PCR基因扩增仪及凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；
微量分光光度仪购自Bio-Tek公司；
电泳槽设备购自北京六一电泳设备有限公司；
摇床购自上海福玛实验设备有限公司。

1.2 PCR引物的设计及合成根据NCBI数据库公布的羊布鲁菌16MBtpA和BtpB基因序列，自杀质粒PBKCMV-SacB的载体特征及所含酶切位点信息。此外，引物还应满足自杀载体末端序列与融合片段二端具有15 bp的同源碱基。使用Primer Premier 6.0设计引物（小写部分为相邻片段的同源序列），并送长春市库美生物有限公司合成，引物序列见表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 BtpA和BtpB基因上、下游同源臂的克隆以羊布鲁菌16M基因组DNA为模板，分别使用引物BtpAf-F/ BtpAf-R和BtpAr-F/ BtpAr-R、BtpBf-F/BtpBf-R和BtpBr-F/ BtpBr-R进行PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）：5×PrimerSTAR Buffer 10 μL，dNTP MIX 4 μL，PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O补全。扩增程序：98℃预变性6 min；
98℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环；
72℃再延伸10 min，4℃保存。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，胶回收后，送长春市库美生物有限公司进行测序分析。

1.6 自杀质粒PBK-CMV-SacB线性化于-80℃冰箱取出保存的自杀质粒PBK-CMV-SacB，经SmaⅠ单酶切消化后，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.7 采用无缝克隆技术，构建重组载体以分光光度法测定待融合片段和线性载体的浓度，按照TaKaRa公司无缝克隆重组酶（In-Fusion Cloning）说明书设计反应体系，载体与各插入的片段的最佳摩尔比为1∶2，分别构建了BtpA和BtpB重组自杀载体。将该连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，按TaKaRa公司质粒载体转化方法进行操作。取150 μL转化产物，均匀涂布于含卡那（Kan）抗性的LB固体培养基上，37℃培养10～12 h，挑取单菌落进行PCR鉴定，并将阳性产物测序鉴定。此外，对阳性产物进行SacB基因的PCR检测。将验证正确的产物分别命名为PBK-CMV-SacB-ΔBtpA和PBK-CMV-SacBΔBtpB，于-80℃保存，并使用DANMAN软件绘制构建重组载体的简图（图1，图2）。

图1 重组质粒PBK-CMV-SacB-ΔBtpAFig.1 Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpA

图2 重组质粒PBK-CMV-SacB-ΔBtpBFig.2 Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpB

1.8 BtpA和BtpB基因的分子生物学预测利用分子生物学软件DNAStar、SignaIP-4.1Server和NCBI网上数据库等，对羊布鲁菌效应蛋白BtpA和BtpB进行了基因序列同源性，信号肽、二级结构以及抗原表位的深入分析。

2.1 BtpA和BtpB上、下游同源臂的PCR扩增以羊布鲁菌16M基因组为模板，利用上、下游同源臂引物分别获得了BtpA上、下游同源臂片段（835 bp）和BtpB上、下游同源臂片段（824 bp）。其测序结果显示未出现碱基突变，碱基序列与模板完全一致（图3，图4）。

图3 上游同源臂BtpAf和下游同源臂BtpAr的PCR结果Fig.3 The electrophoresis result of PCR product of upstream homology arm BtpAf and downsteam homology arm BtpAr

图4 上游同源臂BtpBf和下游同源臂BtpBr的PCR结果Fig.4 The electrophoresis result of PCR product of upstream homology arm BtpBf and downsteam homology arm BtpBr

2.2 自杀质粒PBK-CMV-SacB酶切鉴定对自杀质粒PBK-CMV-SacB进行单酶切鉴定，PCR结果显示，单酶切后质粒上移，与预期大小相符，说明自杀质粒酶切成功（图5）。

图5 自杀质粒PBK-CMV-SacB酶切鉴定结果Fig.5 Restriction map of Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB

2.3 重组载体鉴定将转化产物，用特异性引物进行PCR鉴定，结果显示：BtpA上、下游同源臂片段和BtpB上、下游同源臂片段分别插入了载体（图6，图7）。重组质粒的测序结果也验证了待融合片段成功整合到了自杀质粒PBK-CMV-SacB上。此外，对验证正确的产物进行了SacB基因的检测，得到了1600 bp的条带（图8）。

图6 重组载体PBK-CMV-SacB-ΔBtpA的PCR鉴定Fig.6 The electrophoresis result of PCR product of Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpA

图7 重组载体PBK-CMV-SacB-ΔBtpB的PCR鉴定Fig.7 The electrophoresis result of PCR product of recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpB

图8 重组载体SacB基因的PCR鉴定Fig.8 The electrophoresis result of PCR product of recombinant plasmid SacB gene

2.4 BtpA和BtpB分子生物信息学方法的预测

2.4.1BtpA和BtpB基因序列分析 在NCBI数据库上，搜索布鲁菌不同种属、不同生物型的BtpA和BtpB基因序列，经线上BLAST软件比对分析后，发现其核苷酸同源性均在99%以上。表明了BtpA和BtpB基因在布鲁菌中差异性极小、高度保守。

2.4.2 BtpA和BtpB信号肽及其切割位点的预测 在NCBI线上数据库下载羊布鲁菌BtpA和BtpB的氨基酸序列。并利用线上软件SignaIP-4.1Server对BtpA和BtpB氨基酸序列的信号肽及其切割位点进行预测。软件通过计算分析得到效应蛋白BtpA和BtpB均不具有信号肽，分别在21和60位氨基酸处存在切割位点（图9，图10）。

图9 BtpA 信号肽预测Fig.9 Signal peptide predictionof BtpA protein

图10 BtpB信号肽预测Fig.10 Signal peptide predictionof BtpB protein

2.4.3 BtpA和BtpB二级结构的预测 将BtpA和BtpB氨基酸序列导入DNAStar软件包中protean，按照Garnier-Robson Chou-Fasman 及Karplus-Schulz方法进行二级结构的解析预测。结果可知，效应蛋白BtpA和BtpB均具有α-螺旋、β-折叠及无规则卷曲等丰富的二级结构。同时分析到柔性结构区域在BtpA N-端的5-14、18-41、44-65、69-75、79-88、92-118、124-134、139-143、151-157、167-169、182-198、210-212、216-220、226-231、242-254、259-265处，而在BtpB N-端的8-14、31-46、52-55、65-69、77-82、123-131、134-138、139-147、163-170、182-183、189-192、198-206、211-214、222-230、245-248、255-259、265-269、274-279处，在柔性结构区域易于形成抗原表位（图11，图12）。

图11 按Garnier-Robson Chou-Fasman法预测BtpA和BtpB蛋白的α-螺旋和β-折叠区域Fig.11 Alpha helix and beta fold regions of BtpA and BtpB protein predicted by the methods of Garnier-Robson and Chou-Fasman

图12 按Garnier-Robson chou-Fasman及Karplus-Schulz法预测BtpA和BtpB蛋白的二级结构柔性片段Fig.12 Flexible regions prediction of secondary structure of BtpA and BtpB protein by the methods of Garnier-Robson Chou-Fasman and Karplus-Schulz

2.4.4 BtpA和BtpB B细胞抗原表位的预测 按照算法Kyte-Doolittle、Emoni及Jameson-Wolf分别对蛋白的亲水性、表面可及性和抗原性进行了预测，结果如图13所示。对B细胞抗原表位的预测，需将蛋白的二级结构柔性区域、亲水性、表面可及性和抗原性作综合分析。结果显示，极有可能是B细胞抗原表位的分别是BtpA N-端5-13、18-40、49-65、79-88、92-101、139-143、151-157处，以及BtpB N-端8-14、31-39、189-192、223-230、246-250处。

图13 BtpA和BtpB蛋白亲水性、表面可及性和抗原性的预测Fig.13 Analysis of hydrophilicity、surface probability plot and antigenic index of BtpA and BtpB protein

布病作为一种重要的人畜共患传染病，对其毒力因子的研究一直是布鲁菌病原免疫学的重要内容之一。BtpA和BtpB作为布鲁菌分泌的一种具有Toll受体结构域的毒力因子，一旦进入宿主细胞，就会与MyD88相互作用，进而干扰TLR信号传导并调节微管动力学[7-8]。在大肠杆菌、肠沙门菌、鼠疫耶尔森氏菌等病原微生物中，均发现了含TLR结构域的毒力蛋白[9]。Felix等[10]通过建立BtpA和BtpB真核表达载体，发现了BtpA和BtpB可调控胞内ATP和NAD分子水平，破坏宿主细胞的能量代谢，为解释布鲁菌的生存机制提供了新的思路。但是，目前对于BtpA和BtpB如何调控宿主的信号通路还存在争议[11-12]。基因缺失技术作为研究病原菌致病机制的基本手段之一，在研究毒力因子功能中被大量使用。本试验通过利用无缝克隆技术（in-fusion），成功构建了无痕基因缺失突变载体。该技术与经典的克隆方式不同[13-16]，其设计引物时，需要线性载体末端和待融合片段具有15-20个相同碱基。依靠碱基间的作用力实现同源重组，无需连接酶即可成环状，直接用于转化宿主菌[17]。极大简化了构建载体的步骤，并可一次性进行多片段的连接，降低了成本，提高了效率。为以后基因敲除提供了新的思路。

此外，经分子生物信息学软件对BtpA和BtpB功能进行预测。发现BtpA和BtpB序列高度保守，不同种属之间仅有个别核苷酸的差异，说明了BtpA和BtpB可能对布鲁菌生命活动是必要的。BtpA和BtpB蛋白均无信号肽，表明其可能属于非分泌型蛋白，需要借助非经典途径进入宿主细胞发挥调控作用。效应蛋白BtpA和BtpB为α-螺旋为主的二级结构，拥有一定量的B细胞抗原表位，可作为鉴别诊断试剂和亚单位疫苗的候选基因。但具体的分子生物学功能需要进一步通过试验验证。

本研究通过构建BtpA和BtpB无痕缺失突变载体，并利用生物信息软件对其功能进行了预测，为进一步解析布鲁菌的致病机制提供了工具和信息数据支持。