耐性微生物的驯化过程及对Cd2+的去除性能研究

刘上游 赵丹 陈米雪 秦洪康

（长沙理工大学水利工程学院，湖南长沙 410004）

即使微量的重金属（HMs）也会对环境及人体产生负面影响［1］。其中，Cd2＋会影响生殖系统、抑制酶活性并毒害肾脏和肝脏等器官［2］。近年来，工业化的快速发展以及频繁的人类活动，加剧了HMs 向水环境中的释放。因此，HMs 水污染问题已成为人类面临的严重环境挑战［3］。

有学者开发了包括离子交换和过滤等技术在内的各种技术［4］以应对HMs 水污染问题，但其存在效率低、成本高、工艺复杂等缺点［1，5-6］。因此，开发简单高效且成本低廉的HMs 修复技术至关重要。耐性微生物技术因其具有针对性强、操作简单的特点，引起了广泛关注［7］。细菌作为常见微生物，也已被证明对HMs 具有优异的吸收能力，如Paenibacillus sp.WP-1［8］。

本研究主要目的是从含镉人工湿地生物膜中分离和筛选耐性微生物，对其驯化过程进行生长监测、抵抗性能监测和分析，并评估其在不同pH 下对镉的去除效果。

2.1 试剂与材料

胰蛋白胨，酵母提取粉，BR（生化试剂），分别购自国药集团化学试剂有限公司和广东环凯微生物科技有限公司。硫酸镉，AR（分析纯），99%，购自上海麦克林生化科技有限公司。其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。实验用水均为超纯水。

2.2 耐性微生物的培养与驯化

微生物取自人工湿地基质层生物膜，将其加入到LB 培养液中培养，每2 d 更换1 次培养液，使微生物保持较高生长活性。随后取1 mL 微生物依次加入到不同浓度的含镉LB 培养液中培养48 h，直至培养液中Cd2＋浓度为200 mg/L。在驯化的过程中，每隔0，1，3，6，9，12，24，48 h 通过紫外可见分光光度计监测微生物的OD600值。

2.3 pH 变化对去除性能的影响

微生物培养至对数生长期后，取1 mL 微生物加入到初始浓度为40 mg/L，pH 变化范围为2～6 的不同模拟废水中，待反应平衡后取样，通过0.22 μm 微孔滤膜过滤，并使用原子吸收分光光度计测定溶液中剩余镉浓度。以上培养过程均在150 r/min、28 ℃的恒温摇床中进行。

3.1 原始微生物生长状态监测

原始微生物的生长状态监测结果见图1。如图1所示，在没有Cd2＋胁迫的情况下，微生物的OD600值在3～6 h 内增长速率最快，且能够在6 h 内达到对数生长期。随着时间的延长，微生物增速变缓。

图1 原始微生物的生长状态监测结果

3.2 微生物抵抗性能监测

耐性微生物在不同浓度Cd2＋胁迫下的生长状态如图2 所示。

图2 不同浓度Cd2＋胁迫下微生物的OD600 值及Cd2＋去除率

除200 mg/L Cd2＋胁迫下的微生物以外，其余浓度Cd2＋胁迫下的微生物均能在48 h 内达到对数生长期。随着Cd2＋浓度的增加，达到对数生长期所需时间随之延长，说明Cd2＋抑制了微生物的生长。25～125 mg/L Cd2＋胁迫下的微生物生长状态相近，此时微生物仍有良好耐受性。Cd2＋浓度从150 mg/L 增加至200 mg/L，Cd2＋离子对微生物的抑制作用明显。

微生物在高浓度Cd2＋胁迫下去除效果明显低于低浓度下的去除效果，且48 h 高于24 h。微生物在25 mg/L Cd2＋胁迫下效果最佳，但48 h 去除率（55.96%）低于24 h 去除率（60.68%），这可能是微生物裂解死亡导致Cd2＋离子重新释放。随着Cd2＋浓度增加，去除率出现波动。75～125 mg/L Cd2＋胁迫下，微生物生长逐渐变缓且去除率呈总体下降趋势，在125 mg/L 达到最低点，此时难以耐受的微生物死亡，微生物开始筛选。此后，Cd2＋胁迫加强，微生物难以正常生长，去除率开始上升并趋于稳定，微生物得到筛选。

3.3 不同pH 下微生物对Cd2＋的去除效果

微生物对Cd2＋的去除效果明显受pH 的显著影响，见图3。微生物在pH 为2 时的作用最差（10.1%），此时溶液中剩余Cd2＋浓度为35.95 mg/L。在pH 为6时效果最好，去除效率提升至96.1%，此时溶液中的剩余Cd2＋浓度为1.56 mg/L。这可能是因为酸性环境中微生物无法正常生存，因此难以发挥作用，而偏中性的环境为微生物生存创造了适宜的空间。

图3 不同pH 下耐性微生物对Cd2＋的去除率

本实验将取自人工湿地基质层生物膜原始微生物培养、驯化，监测微生物生长状态和去除效果，并考察pH 变化对耐性微生物去除Cd2＋效果的影响。所得结论如下：

（1）随着Cd2＋的浓度升高，微生物生长到对数生长期的时间随之延长。

（2）微生物对25～125 mg/L Cd2＋胁迫具有良好的耐受性。150～200 mg/L 的高浓度Cd2＋胁迫下，Cd2＋离子对微生物的生长抑制作用明显，部分微生物难以耐受并死亡，且此时微生物对Cd2＋的去除效果趋于稳定，微生物得到筛选。

（3）耐性微生物对Cd2＋的去除效果受水环境中pH 的显著影响，在酸性条件下，微生物对水中Cd2＋的去除效果受到明显抑制，甚至可能抑制微生物自身生长繁殖。而偏中性的水质条件为微生物提供了适宜的生存环境，从而提高了微生物对Cd2＋的去除效果。