响应面优化微波协同双水相体系提取咖啡豆中绿原酸的工艺研究

◎ 郑 琰，赵丽娟

（普洱学院，云南 普洱 665000）

咖啡是众多消费者喜爱的饮品，其营养价值一直备受关注，尤其是咖啡豆中所含的大量多酚类化合物已成为关注的重点[1]。咖啡豆中的活性物质极其丰富，绿原酸是其主要生物活性成分之一，具有降血压、抗氧化、抗病毒、清除自由基等功效，常应用于食药、化工等行业[2-4]。绿原酸在不同的植物中含量不同，以杜仲叶、蒲公英、葵花籽、咖啡豆中绿原酸类似物的含量较高[5-7]。绿原酸在新鲜咖啡豆中含量占2%～8%，烘焙过后含量会因发生美拉德反应、焦糖化等化学反应降低。

目前国内以咖啡豆作为研究对象提取绿原酸的工艺研究相对较少，云南咖啡年产量位居全国前列，对咖啡豆中绿原酸提取工艺进行研究，提高绿原酸的产率具有很大的研究意义，有必要探究适合于云南咖啡豆中绿原酸提取的有效方法。相较于传统单一的溶剂提取技术，微波技术作为一种新发展起来的加热技术，具有提取速度快、对样品破坏小、体系受热均匀等特点[8-9]。作为新型的溶剂萃取分离技术，双水相萃取根据组分在两相间的选择性分配从而达到目标成分分离的目的，提取过程中能有效保护目标成分的生物活性，并且双水相萃取操作简单、反应速度快、选择性强、成本低、破坏小，对于天然活性物质的分离纯化，其效率更高，并且不会残留有机溶剂造成危害[10-12]。双水相萃取体系，若加以微波辅助，能有效提高提取率、减少反应时间和萃取成本，并且安全、环保[13-16]。

本文根据双水相的特点，采用微波技术协同乙醇-磷酸氢二钾双水相体系提取云南小粒咖啡豆中的绿原酸，并采用响应面法优化提取体系，为云南小粒咖啡中绿原酸的提取奠定理论基础，为咖啡豆中的绿原酸资源利用提供参考。

1.1 材料与设备

试剂：无水乙醇（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；
磷酸氢二钾（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；
绿原酸标准品（中国食品药品检定研究院）。

仪器：紫外-可见分光光度计[UV-2600，岛津企业管理（中国）有限公司]；
格兰仕微波炉（P70F20CN3LHP3，广东格兰仕微波生活电器制造有限公司）。

咖啡豆样品：购于云南某咖啡公司，用蒸馏水将咖啡豆洗净，烘干，取出后粉碎成粉末，过30 目筛，装袋密封备用。

1.2 实验方法

1.2.1 绿原酸标准溶液的配制

分别准确移取不同体积的100 μg·mL-1绿原酸标准储备液配制成浓度为0 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、8.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1的标准溶液，在331 nm 波长处测定吸光度值，绘制标准曲线。

1.2.2 咖啡豆绿原酸含量的测定

按一定比例配制乙醇-磷酸氢二钾双水相体系，加入准确称取的咖啡豆粉末样品，在一定微波功率下加热萃取，离心，取上清液稀释定容，在331 nm 波长下测其吸光度，代入标准曲线方程，得到样品溶液中绿原酸浓度，按下式计算出样品的绿原酸提取率。

式中：X为绿原酸的提取率，%；
c为样品中绿原酸浓度，μg·mL-1；
V为样液体积，mL；
n为提取液的稀释倍数；
m为样品质量，g。

1.2.3 单因素实验

准确称取咖啡粉末样品1.000 0 g，在固定其他因素不变的条件下，分别探讨不同乙醇体积分数（60%、65%、70%、75%、80%、85%）、不同磷酸氢二钾质量浓度（0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1、0.3 g·mL-1、0.4 g·mL-1、0.5 g·mL-1、0.6 g·mL-1）、不同料液比（1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70）、不同微波功率（210 W、280 W、350 W、420 W、490 W、700 W）、不同微波时间（10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s）对小粒咖啡绿原酸提取效果的影响，并按照1.2.2方法进行测定，计算绿原酸提取率。

1.2.4 响应面优化实验设计

本研究采用Design Expert 8.0.6.1 软件，以乙醇体积分数、磷酸氢二钾质量浓度、料液比、微波时间为变量值，以绿原酸提取率为响应值，建立模型，进行优化实验，通过对响应曲面图和等高线图进行分析，以获取优化参数，因素水平见表1。

表1 响应面实验设计因素水平表

2.1 绿原酸标准曲线的绘制

如图1 所示，绿原酸标准曲线的线性回归方程为y=0.055 9x-0.004 1，相关系数值为0.999 7，说明线性关系良好，标准曲线可用于后续数据分析研究，结果可靠。

图1 绿原酸标准曲线图

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇体积分数

根据单因素实验设计进行实验，由图2 可知，当乙醇体积分数达到75%时，咖啡豆绿原酸提取率得到最大值，为4.05%，故初步选取75%为最佳乙醇体积分数。

图2 乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响

2.2.2 磷酸氢二钾质量浓度

由图3 可知，磷酸氢二钾质量浓度在0.2 g·mL-1时达到最大值4.09%，故初步选取0.2 g·mL-1为最佳磷酸氢二钾质量浓度。

图3 磷酸氢二钾质量浓度对绿原酸提取率的影响

2.2.3 料液比

由图4 可知，咖啡豆绿原酸提取率在一定的料液比条件范围内波动，当物料与溶剂的比例在1 ∶50（g ∶mL）时，提取率达到在此范围内的最大值4.26%，而后逐步降低，故初步选取1 ∶50（g ∶mL）为最佳料液比。

图4 料液比对绿原酸提取率的影响

2.2.4 微波功率

由图5 可知，微波功率在210 ～280 W，咖啡豆中绿原酸的提取率急剧增加，于280 W 达到最大值4.33%，故初步选取280 W 为最佳微波功率。

图5 微波功率对绿原酸提取率的影响

2.2.5 微波时间

由图6 可知，微波时间在10 ～15 s 内，咖啡豆绿原酸的提取率急剧升高且在15 s 时达到了整个时间研究范围内的最大值4.44%。故初步选取15 s 为最佳微波时间。

图6 微波时间对绿原酸提取率的影响

综上所述，初步选取75% 乙醇体积分数、0.2 g·mL-1磷酸氢二钾质量浓度、1 ∶50 料液比、280 W 微波功率、15 s 微波时间的工艺条件用于后续优化研究。

2.3 响应面实验结果

2.3.1 响应面实验设计方案及结果

根据单因素实验的结果，以咖啡豆中绿原酸提取率为因变量，乙醇体积分数（A）、磷酸氢二钾质量浓度（B）、料液比（C）、微波时间（D）4 个因素为自变量，设计响应面分析水平实验，设计水平见表1，优化咖啡豆中绿原酸的提取条件。按照软件所设计的各因素条件进行试验，如表2 所示，计算出相应绿原酸提取率。

表2 响应面实验设计及结果表

2.3.2 回归方程和方差分析

利用Design Expert 8.0.6.1 软件进行多元回归方程拟合方差分析，得到绿原酸的提取率（响应值E）的回归方程为

E=4.48+0.080A-0.046B+0.061C+0.11D-0.078AB+0.013AD-0.043BC+0.067BD+0.030CD-0.15A2-0.026B2-0.076C2-0.17D2

由表3 可知，本实验模型的F值为28.52；
回归方程达到显著（P值＜0.000 1），决定系数R2=0.932 2，说明回归模型可靠。由表中的F值的大小可以看出这4 个因素对绿原酸提取率影响程度为微波时间＞乙醇体积分数＞料液比＞磷酸氢二钾质量浓度。

表3 回归方程的方差分析表

2.3.3 响应面图分析

响应面图中图形曲面坡度的大小、等高线的形状和密集程度能直观反映出两个单因素之间的交互作用大小[17]。各个因素之间的交互作用对绿原酸提取率的影响见图7 和图8，可以据此分析4 个单因素的交互作用。

图7 所示为乙醇体积分数分别与磷酸氢二钾质量浓度、料液比、微波时间两两之间对咖啡豆中绿原酸提取率的交互影响。①比较乙醇体积分数与磷酸氢二钾浓度的交互影响可知，随着乙醇体积分数的增加，绿原酸的提取率变化幅度更大，说明乙醇体积分数相较于磷酸氢二钾质量浓度对响应值的影响更为显著。②在乙醇体积分数与料液比两个因素的交互影响图中，咖啡豆绿原酸提取率随乙醇体积分数变化的曲面较料液比变化曲面陡峭，说明乙醇体积分数的影响大于料液比的影响。③比较乙醇体积分数与微波时间两个因素的交互影，绿原酸提取率随两因素条件的变化均呈先增加后减小的趋势，微波时间对响应值的影响较乙醇体积分数稍大。

图7 乙醇体积分数与其他因素的两两交互影响图

图8 所示为料液比、微波时间、磷酸氢二钾质量浓度3 个因素两两之间对咖啡豆中绿原酸提取率的交互影响。比较3 个因素对咖啡豆中绿原酸提取率的两两交互影响，可知料液比对咖啡豆中绿原酸提取率的影响大于磷酸氢二钾质量浓度；
微波时间对咖啡豆绿原酸提取率的影响明显大于磷酸氢二钾质量浓度的影响；
微波时间对咖啡豆绿原酸提取率的影响大于料液比的影响。

图8 料液比、微波时间、磷酸氢二钾质量浓度3 个因素的两两交互影响图

综上所述，通过比较4 个因素相互作用，它们对咖啡豆中绿原酸的提取率影响大小排列顺序结果与回归方程的方差分析表结果一致，微波时间对咖啡豆绿原酸提取率的影响最大，磷酸氢二钾质量浓度的影响最小。

2.3.4 实验条件的优化、预测和验证

用Design-Expert 8.0.6.1 软件进行分析，能够得到提取云南小粒咖啡豆绿原酸的最优工艺条件，以及最佳提取率的预测值，为了证明响应面优化结果的准确度，在最佳预测条件下进行验证实验，得到绿原酸平均提取率为4.55%，验证值与预测值4.54%相近，证明最佳预测条件下的工艺条件是合理的。

本文研究了微波辅助乙醇-磷酸氢二钾双水相体系提取云南小粒咖啡豆中绿原酸的工艺条件，在单因素实验的基础上，用Box-Behnken 响应面优化法设计模型，进行线性回归方程和二项式拟合，得到提取云南小粒咖啡绿原酸的最佳工艺条件为乙醇体积分数为76.98%，磷酸氢二钾质量浓度为0.14 g·mL-1，料液比为1 ∶54.97，微波功率为280 W，微波时间为15.48 s；
在该优化条件下得到的云南小粒咖啡豆中绿原酸提取率为4.54%，与预测值4.55%相近，说明该方法对提取咖啡豆中的绿原酸效果显著，本研究方法采用微波辅助乙醇-磷酸氢二钾双水相体系提取云南小粒咖啡豆中绿原酸具有一定可行性，为云南小粒咖啡中绿原酸的提取及相关资源开发利用提供一定理论参考。