黏液溶解剂羧甲司坦对急性呼吸道炎症的抑制作用

马瑞娟，周 凤，田豆豆，张 薇，张科东

（1.宁夏医科大学，银川 750004；
2.宁夏医科大学总医院，银川 750004；
3.广州医科大学国家呼吸疾病重点实验室，广州 511495）

呼吸道黏液是呼吸道第一道防御屏障的重要组成部分，在保持呼吸道湿润、俘获外来物质、防止机械损伤以及协助呼吸道上皮细胞功能等方面起着重要作用。当黏液分泌过度或黏滞性增加时，往往会阻塞呼吸道管腔，诱发支气管及肺部感染。黏液的黏性和弹性主要取决于黏蛋白的含量及活性。羧甲司坦（carbocisteine，CAR）是临床上常用的呼吸道黏液溶解剂，能够还原黏蛋白二硫键，降低其黏滞性，使得各种呼吸系统炎性反应形成的呼吸道黏液易于排出。本课题组前期研究[1]发现，CAR能够抑制香烟提取物（CSE）诱导的人肺泡上皮A549细胞的炎性反应，故推测CAR除了协助呼吸道黏液排出，也具有一定的抗炎作用。因此，本研究建立体内外模型，旨在探索CAR能否抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠急性呼吸道炎症（acute respiratory inflammation，ARI）反应，为后续呼吸道感染的临床研究提供一定的研究基础。

1.1 材料

人肺泡上皮A549细胞系（中科院上海细胞库），“红玫”牌香烟（广东中烟工业有限公司），CAR粉剂（纯度≥99%）（广州白云山制药），LPS（美国Sigma公司），小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、黏蛋白5AC（Muc5AC）检测试剂盒（美国eBioScience公司），酶标仪及CO2培养箱（美国Thermo公司），倒置相差显微镜（德国Leica公司）。6～8周龄健康无特定病原体（SPF）级雄性C57BL/6j小鼠（广东省医学实验动物中心）。动物实验获得广州医科大学动物管理和使用委员会批准［批准号：SCXK（粤）2018-0008］。

1.2 细胞实验

10%FBS-DMEM常规培养A549细胞，气体采样管（大包氏管）采集香烟主流烟雾，收集CSE，滤除细菌及颗粒，形成100%CSE，30 min内进行后续实验，本实验所需浓度为3%。香烟提取物刺激A549细胞后形成细胞模型。实验分为正常对照（CTL）组、CAR组、CSE组及CAR+CSE组。按照试剂盒说明经酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养液上清中TNF-α、IL-6及Muc5AC的含量。

1.3 动物实验

1.3.1 实验分组 32只6～8周龄雄性C57BL/6j小鼠被随机分为CTL组、LPS组、CAR组、LPS+CAR组，每组8只。

1.3.2 小鼠ARI模型复制及CAR处理 根据文献[1]的方法，1%戊巴比妥麻醉小鼠后，按照1 mg·kg-1的剂量经鼻腔滴入LPS溶液（LPS组），CTL组滴入等量生理盐水。LPS+CAR组小鼠，在滴入LPS溶液后按100 mg·kg-1剂量腹腔注射CAR溶液。正常小鼠腹腔注射等剂量CAR溶液即为CAR组。24 h后采集相应的标本，提取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。

1.3.3 BALF中炎性细胞测试 收集BALF沉淀细胞，裂解去除红细胞，进行细胞计数。剩余细胞沉淀涂片，4%多聚甲醛固定，苏木素-伊红（HE）染色，进行巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞分类及计数。

1.3.4 ELISA检测 收集去杂质的细胞培养上清，ELISA检测细胞上清中Muc5AC含量，按照处理组/正常对照组×100%的公式计算细胞培养上清中Muc5AC的相对含量。收集ARI小鼠BALF，离心去除细胞杂质后按照试剂盒说明，检测BALF中TNF-α及IL-6的含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2.1 CAR抑制CSE刺激下的A549细胞分泌炎性因子TNF-α和IL-6

ELISA测定细胞上清液中炎性因子的含量，与CTL组相比，CSE组的TNF-α、IL-6水平均升高（P均＜0.05），给予CAR处理后，CSE+CAR组的TNF-α和IL-6水平均下降（P均＜0.05），见图1。

图1 CAR抑制CSE刺激下的A549细胞分泌炎性因子TNF-α及IL-6

2.2 CAR抑制CSE刺激下A549细胞分泌Muc5AC的水平

ELISA结果显示，与CTL组相比，CSE组细胞培养液中Muc5AC水平升高，CSE+CAR组Muc5AC的水平降低（P均<0.05），见图2。

图2 CAR抑制CSE刺激下A549细胞分泌Muc5AC的水平

2.3 CAR对ARI小鼠BALF中白细胞数及中性粒细胞数量的影响

CTL组小鼠BALF中白细胞数较少，以淋巴细胞为主。CAR组对BALF细胞数量及比例无影响。与CTL组相比，LPS组小鼠BALF中白细胞数与中性粒细胞数均增加（P均<0.01）；
与LPS组相比，LPS+CAR组小鼠BALF中白细胞数及中性粒细胞总数均减少（P均<0.05），见图3。

图3 CAR对ARI小鼠BALF中白细胞数及中性粒细胞数量的影响

2.4 CAR对ARI小鼠BALF中炎性因子TNF-α及IL-6分泌的影响

LPS组BALF中TNF-α及IL-6的水平均高于CTL组（P均<0.01）；
LPS+CAR组BALF中TNF-α及IL-6水平均低于LPS组（P均<0.01），见图4。

图4 CAR对ARI小鼠BALF中TNF-α及IL-6分泌的影响

呼吸道感染是常见的呼吸系统疾病，主要表现为炎性介质释放以及呼吸道分泌物反应性增多等。尽管黏液在维持呼吸道屏障中具有重要作用，但分泌过度或理化性质发生改变时，往往会阻碍正常的气体交换。CAR是常用的黏痰溶解剂，其结构中包括的巯基可结合活性氧的亲电子基团，消灭氧自由基，促进还原型谷胱甘肽生成，还原黏液主要成分黏蛋白二硫键，破坏其空间结构，降低黏滞性，使得痰液易于排出[2]。当前有关CAR的应用主要集中在抑制慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张等慢性呼吸道炎症性疾病的发生中[3-4]，关于其在ARI中的直接抗炎作用鲜有报道。有报道[5]提示，CAR能够降低流感病毒等病原体对呼吸道上皮细胞的损害，表现出一定的抗炎效果。课题组前期的研究[6]结果亦提示，CAR可以降低急性肺损伤小鼠呼吸道Muc5AC的分泌。然而CAR调节Muc5AC与炎性介质分泌的关系并不清楚。本研究证实了正常组细胞培养液中Muc5AC分泌程度低，而且单纯CAR并不会影响A549细胞中Muc5AC的分泌。和CTL组相比，CSE暴露下的细胞培养上清中Muc5AC分泌量增加，CAR可以降低CSE刺激引起的Muc5AC的上调。黏液的增多或减少是临床评价感染是否有效控制的重要指标。正常情况下，呼吸道黏膜上覆盖黏液层，形成一道可靠的防护屏障，可分隔各种有害物质及致病微生物，并经纤毛有节律的摆动来排除异物。在急慢性呼吸道炎症中，可出现上皮细胞增生、腺体肥大或增生，或杯状细胞化生，导致黏液分泌明显增加，接连不断地呼吸道黏液异常分泌以及流变学特征的变化会引起呼吸道纤毛清除能力下降、消失，使细菌容易定植在此处，甚至产生炎性改变，还会导致支气管中小呼吸道阻塞、气流不通畅、气体交换功能受阻等，最终使得呼吸道炎症长久不愈[7]。课题组前期的另一项报道[8]提示，LPS可以通过增加TNF-α的分泌从而促进另一种黏蛋白（Muc1）的分泌，通过调节TNF-α受体来降低Muc1的分泌程度。尽管CAR的药物机制是通过破坏黏蛋白构象促进其排出，但是细胞实验和动物实验均提示CAR抑制了急慢性炎症环境下的黏蛋白表达。因此推测其降低CSE或LPS所致的Muc5AC分泌的机制可能与其抗氧化作用下调炎性因子TNF-α和IL-6等有关，后两者正是促进Muc5AC表达的正性调控分子[9]。

A549细胞系是研究呼吸道及肺实质病变最常用的细胞[10]。TNF-α和IL-6的表达或分泌与多种炎症密切相关，可有效反映体内或体外的总体炎性水平[11-12]。本研究的细胞实验用CSE刺激A549细胞，通过检测细胞培养液，发现炎性因子TNF-α和IL-6的表达升高。CAR能够抑制CSE诱导的TNF-α和IL-6的分泌，其抗炎作用可能与抑制Muc5AC表达有关。

本研究细胞实验和动物实验均表明，CAR能够抑制炎性反应，提示CAR除了能够破坏黏蛋白构象、促进黏液溶解易于排出外，还可抑制呼吸道上皮炎性反应，进而抑制黏蛋白表达和分泌。