结直肠癌患者肠道菌群与肠道免疫微环境关系的研究进展

朱琨 卢清军 任翔 蒋宏

滨州医学院附属医院结直肠疝外科，滨州 256000

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）目前居全球肿瘤疾病发病谱第3位和死因谱第2位。据国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症数据显示，全世界有超过193万人新确诊为CRC，其中，中国有超过55万人为初诊CRC患者，占中国新确诊肿瘤人数的12.2%。数据表明，中国已成为全球CRC每年新发病例数和死亡病例数最多的国家，CRC严重影响和威胁我国居民身体健康［1］。目前，结肠癌的干预策略，如粪便微生物群移植、益生元、益生菌以及抗生素干预等，均显示出作为肠道菌群调节剂的潜在治疗价值。然而，肠道菌群的最终治疗作用与其功能状态及机体的免疫微环境关系密切。因此，探究肠道微生物群相关的系统生物学功能和潜在的分子机制对于发现新的、可操作的靶点以用于未来CRC患者的干预和临床评估有至关重要的价值。

肠道菌群庞大且复杂，多达100万亿个微生物居住在肠道中，其密度接近每毫升1011～1012个细胞。肠道菌群作用于肠道微环境中的其他代谢物，在维持机体内环境稳态中发挥着重要的作用。机制十分复杂，目前的研究尚不明确。

肠道菌群与肿瘤的关系密不可分，不仅可直接促进肠道肿瘤的发生，肠道菌群及其代谢物还可影响远离肠道部位的癌症发展。例如，菌群从肠腔易位到胰腺促进胰腺肿瘤的发生；
肝脏中没有肠道菌群，然而，肠道菌群通过炎症微生物相关的分子模式和细菌代谢物促进肝细胞癌的发生［2］；
肠道菌群还是胰岛素抵抗的关键因素，是多囊卵巢综合征发生的重要原因之一［3］。

CRC中宿主与菌群的相互作用关系被初步证明于1975年，当时观察到致病性二甲基肼在无菌大鼠中诱发的结肠肿瘤明显少于肠道菌群正常的大鼠。此外，相对于接受健康菌群的小鼠而言，接受CRC粪便菌群的小鼠肠息肉数量更多。由于包括16S rRNA和鸟枪法宏基因组学在内的微生物组分析技术的发展，与健康对照个体相比，CRC患者的肠道菌群成分有差异是显而易见的，被概括为“菌群失调”。在CRC肿瘤组织中检测出较高含量的核梭菌、大肠埃希氏菌、脆弱拟杆菌、粪肠球菌、解脲链球菌和消化链球菌菌种，而所谓的保护性菌属包括罗氏菌、梭菌、费卡杆菌和双歧杆菌在内的细菌数量明显减少［4-5］。这些差异中的一些（梭菌水平最一致）与临床结局和化疗敏感性相关，因此这类细菌具有作为生物标志物的潜力。然而，这种菌群类型和数量的变化究竟是癌症的原因还是结果，是否能将CRC的发生归因于某些特定的“致癌”微生物，仍具有挑战性。

肠道是人体最大的消化器官，除了通过消化食物以促进营养物质的吸收外，肠道还具有多种其他功能，包括传递信息和调节新陈代谢［6］。肠道的独特结构使其长期暴露于各种抗原和微生物之中，为了保护机体免受病原体的侵害以及维持内环境稳定，人体肠道已经进化出成熟的肠道免疫系统［7］。这个错综复杂的系统由肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）、固有层细胞及肠淋巴组织细胞构成。其中IECs是肠道免疫系统的单层物理屏障，而屏障的完整性由上皮间紧密连接蛋白和保护性黏蛋白的分泌进一步加强。除了作为物理屏障的功能外，IECs还通过模式识别受体感知肠道菌群。刺激这些受体可促进上皮细胞修复和紧密连接蛋白的上调，并触发向固有层细胞发出信号的各种细胞因子的产生。更重要的是，IECs不是孤立的，而是作为免疫细胞和间充质的三联体。如果上皮屏障防御被微生物或其产物破坏，免疫细胞和间充质细胞通过启动维持上皮完整性的信号网络级联，充当第二道防线［8］。例如，核因子激活的B细胞的κ-轻链增强（nuclear factor kappa-B，NF-κb）和信号转导和转录激活3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路的激活可以触发生长因子和细胞因子的产生，从而支持稳态组织修复［8］。

肠道免疫系统的激活取决于病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的表达，例如肠道微生物产物。肠道菌群分泌的多种代谢物、细菌素以及其他PAMPs通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）和其对上皮细胞的粘附激活肠道免疫系统，进而影响CRC的发生和发展。肠道中的IECs及免疫细胞表达一系列PRRs，如Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）和NOD样受体（NOD-like receptors，NLRs）。这些受体能够直接感测碳水化合物和脂质基细菌细胞壁成分，例如脂多糖、肽聚糖、脂质酸和其他PAMPs，从而激活免疫系统［9］。某些细菌分泌的脂蛋白和脂多糖能够被髓系细胞、黏膜上皮细胞和其他免疫细胞表面的TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-6、TLR-10识别［10］。分节丝状细菌、沙门氏菌和病态变形杆菌等通过TLRs激活吞噬细胞，并进一步诱导适应性免疫细胞中Th17和Th1反应的激活，分泌促炎细胞因 子 ，如 白 细 胞 介 素（interleukins，ILs）IL-1β、IL-6和IL-23［11］。

1、促进肠道免疫系统的发育

有研究表明，在婴儿时期，肠道内定植的微生物群落可刺激肠黏膜相关淋巴组织的成熟［12］。如果在这个时期未能形成适当的肠道菌群，肠道免疫系统将会受到影响进而导致CRC的发病率增加。

2、调控肠道中T、B淋巴细胞分化

肠道中的T淋巴细胞以及B淋巴细胞位于IECs下层的固有层。在健康个体中，肠道菌群能通过调节T淋巴细胞以及B淋巴细胞等刺激先天性免疫和获得性免疫或阻止不适当的先天性免疫和获得性免疫来维持肠道稳态。梭状芽孢杆菌等革兰阳性菌能够促进小鼠免疫反应，尤其能诱导调节T细胞及辅助性T细胞Th17细胞的增殖分化，并促进肠道Th17细胞产生IL-17［13］。肠道菌群在诱导B淋巴细胞合成与释放分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）的过程中起关键作用，而SIgA是肠道菌群影响宿主的主要关键因子［14］。

3、促进细胞因子产生

细胞因子是由免疫细胞产生的，具有调节免疫、炎症及造血功能的小分子蛋白质，包括ILs、肿瘤坏死因子、干扰素、转化生长因子和趋化因子等。Satoh-Takayama等［15］研究发现肠道菌群诱导自然杀伤细胞产生IL-22，促进机体产生黏膜免疫。

4、促进肠道黏膜内基因的表达

肠道微生物能够上调小鼠各肠段内多种基因的表达，包括与免疫相关的基因如CCL5和CXCL9等，以及肠道屏障功能相关的基因如小脯氨酸丰富蛋白1A（SPRR1A）和高分子黏蛋白2（MUC2）等［16］。

肠道菌群通过改变肠道免疫系统的结构和功能重塑免疫微环境影响CRC的发生。研究报道，肠道菌群可以分泌多种代谢物和细菌素，同时，其也通过表达特定的抗原、对上皮细胞的粘附以及与PRRs的相互作用来激活肠道免疫系统。肠道免疫系统的稳定会保护肠道黏膜，但当稳定被打破，也可能导致一系列促炎细胞因子过量释放加重肠道炎症，继而癌变。

Wu等［17］学者通过小鼠实验发现产肠毒素的脆弱芽孢杆 菌 （Enterotoxigenic Bacteroides fragilis，ETBF） 在ApcMin/+mice80中诱导由STAT3激活驱动的促致癌Th17反应。伴随着单核细胞样髓系来源抑制细胞（monocytic-like myeloid-derived suppressor cells，M-MDSCs）的募集和分化，肿瘤内IL-17A结合IL-17R+髓系细胞驱动Nos2上调。这些M-MDSCs抑制细胞毒性CD8+T细胞的活性，同时诱导肿瘤生长和血管生成相关基因的表达［18］。值得注意的是，ETBF可能会引起远端结肠MDSCs积聚，上皮细胞中的NF-κb信号触发髓细胞募集趋化因子CXCL1和CXCL2的表达［19］。该研究是少数几个考虑肿瘤位置的研究之一，肿瘤位置是一个重要的变量，为整个结肠中不同的微生物和免疫生态位以及临床前CRC模型中微生物群的位置特异性效应提供了证据。在人体中，ETBF同样以NF-κb依赖的方式诱导上皮细胞表达和分泌CXCL1直系同源物IL-8［20］。

在硫酸葡聚糖钠盐诱导的CRC小鼠模型中，用溶血性链球菌灌胃会导致肿瘤负荷增加、诱导免疫抑制性CD11b+髓系群体以及髓系来源的细胞因子（包括IL-6和IL-8）水平增加［21］。在喂食有核粒细胞的ApcMin/+小鼠中，肿瘤负荷增加的同时，肿瘤内免疫抑制性髓样细胞的数量也增加，主要包括单核和粒细胞骨髓间充质干细胞、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关中性粒细胞和树突状细胞。在离体共培养实验中，分离小鼠肿瘤的骨髓间充质干细胞和肿瘤相关巨噬细胞能够抑制CD4+T细胞的增殖［22］。有研究发现，厌氧消化链球菌通过选择性粘附结肠癌细胞并诱导NF-κb，也可引发ApcMin/+小鼠中肿瘤前髓细胞群的扩增，同时，调节性T细胞、Th17和细胞毒性CD8+T细胞也会随之增加［23］。国外学者研究发现具核梭杆菌还可以以细胞因子的方式直接抑制自然杀伤细胞毒性，使肿瘤能够逃避免疫破坏［24］。

肿瘤细胞通过募集某些免疫细胞营造适宜肿瘤生长的微环境，而肠道菌群可以通过影响这些免疫细胞的密度和组成进而影响肿瘤细胞生长。例如，拟杆菌门和厚壁菌门可以通过淋巴细胞吸引趋化因子CCL5、CCL20和CXCL11，同时具核细菌和大肠杆菌可以通过体外途径诱导趋化因子产生［25］。但肠道菌群诱导的免疫细胞对肿瘤细胞起抑制还是保护作用，目前的研究尚不一致。有研究证实，在IECs缺乏自噬调节基因Atg7的小鼠中，微生物菌群与细胞毒性CD8+T细胞和CD4+Th1反应存在相关性，但也有研究证实，CD8+T细胞并不总是抑制肿瘤生长的。一种以普雷沃氏菌科的丰度增加为特征的小鼠微生物群诱导CD8+T细胞产生，但其表现为较高的肿瘤负荷。尽管相互关联，这项研究强调了表征细胞的激活状态及其丰度的重要性，因为功能失调的T细胞可能有助于肿瘤的逃避［26］。

CRC还与细菌失调导致促炎性细胞因子的产生息息相关，包括IL-1β、IL-23、IL-22、IL-27，特别重要的是IL-17A和IL-6［27-29］。在小鼠和人类中，发现IL-6、IL-23和IL-17A在被细菌浸润的肿瘤中的表达增加［28-29］。IL-23和IL-6是Th17衍生细胞因子IL-17A和IL-22的有效诱导剂［30］；
此外，IL-6与其在IECs上的受体结合，引发异常增殖［31-33］。国外学者进一步研究了受体表达模式的重要性，该研究表明CD4+T细胞特异性切除IL-1受体可减少CRC引发的炎症，而髓系细胞上的这种受体缺乏则提高了肠道细菌的侵袭能力和IL-17A的分泌活性，进而促进CRC的进展［34］。

肠道菌群可以通过TLR/Myd88依赖性信号通路促进IECs对IL-17C的上调来促进CRC的发展。IL-17C以自分泌方式诱导凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-xl在IECs中的表达，以促进细胞存活和肿瘤发生。例如，具核梭杆菌能够通过TLR4和TLR2影响CRC。TLR2/4的刺激导致miR-18a和miR-4802表达选择性缺失，导致自噬相关蛋白ULK1和ATG7表达降低以及miR-34a表达上调，从而使CRC细胞对化疗的耐药性增加以及促进CRC的进展［35］。

综上所述，肠道菌群可以调节宿主肠道免疫微环境，并有助于维持肠道免疫微环境的稳态和抑制过度炎症。然而，当肠道菌群紊乱，一些致病菌属增多时，可以通过改变免疫细胞的密度和组成、刺激促炎细胞因子过量释放等机制影响肠道免疫微环境，进而促进CRC的产生与发展。因此，某些特殊的肠道微生物、相关代谢产物以及特异性免疫细胞的差异表达在CRC的早期诊断方面具有潜在的应用价值，值得进一步的临床与基础研究。