葡萄糖调节蛋白78在原发性肝癌患者癌组织中表达及其与预后的关系

苏博 钱国武 闫振宇 张森 王晶璇

(南阳市中心医院 1病理科，河南 南阳 473000；
2普通外科)

原发性肝癌(PHC)属于我国常见的恶性肿瘤，流行病学研究结果显示，中国肝癌粗发病率为25.9/10万，是全球肝癌粗发病率的2倍〔1〕。由于PHC早期诊断率低、高侵袭性及放化疗不敏感等多种危险因素导致其病死率较高，临床预后差〔2〕。PHC的发生发展与肿瘤局部微环境有关〔3〕，葡萄糖调节蛋白(GRP)78属于热休克家族成员之一，与内质网应激有关〔4〕，参与了乳腺癌〔5〕、食管癌〔6〕等多种肿瘤的发病机制，目前关于PHC组织中GRP78表达水平与预后的相关性尚不清楚，本研究通过采用免疫组化方法检测PHC组织中GRP78的表达水平，探讨其与临床-病理特征及预后的相关性。

1.1一般资料 选取2012年1月1日至2014年12月31日于南阳市中心医院普外科和肝胆胰腺外科择期行肝癌根治术的96例PHC患者(PHC组)和45例腹部外伤患者(对照组)。PHC组男50例，女46例，平均年龄(55.12±6.49)岁；
对照组男25例，女20例，平均年龄(57.10±5.23)岁。两组性别和年龄比较无显著差异(P>0.05)。PHC患者纳入标准：①年龄≥18岁；
②肿瘤组织完整切除，即术后影像学证实无恶性组织残留，手术切缘周围均阴性，术后组织病理学证实为PHC；
③术前和术后均未进行放疗、化疗及生物制剂治疗等；
④临床资料完整及配合随访。排除标准：①合并严重心功能不全、肾功能不全、心脏病及其他恶性肿瘤；
②合并严重黄疸、腹腔积液、门静脉主干栓塞、凝血功能障碍等。所有患者术后每3个月进行复诊1次，必要时进行影像学检查，生存期为手术后第1日计算，终止日期为患者死亡日期或末次随访日期，本研究中末次随访截止日期为2019年12月31日，总生存时间定义为手术后至死亡或最后随访时间。另选取3例PHC患者手术后新鲜癌组织和癌旁组织及3例腹部外伤行肝脏探查术患者的正常肝脏组织，对癌组织、癌旁组织及正常组织中GRP78蛋白的表达水平的差异进行Western印迹检验，3例PHC患者纳入和排除标准同上述。所有研究对象知情同意且签署知情同意协议书，本研究经过医院伦理委员会批准同意(LCLL-20130516)。

1.2实验方法

1.2.1试剂 兔源性GRP78单克隆抗体购买于万类生物科技有限公司(沈阳，中国)。免疫组化(SP)染色试剂盒及二抗〔辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG〕购买于上海碧云天生物试剂有限公司(上海，中国)。

1.2.2SP SP法进行SP染色，取南阳市中心医院病理科石蜡包埋的切片，连续切片后制成4 μm厚度切片，常规进行脱蜡和水化，柠檬酸钠缓冲液加热进行抗原修复，3%过氧化氢溶液室温孵育15 min用于阻断内源性过氧化物酶，再次采用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3 min。10%山羊血清室温封闭30 min，滴加一抗后4℃孵育过夜，复温后PBS洗涤3次，每次3 min，滴加二抗室温孵育30 min。切片用DAB显色，苏木精复染。切片冲洗干燥后中性树胶封片。以已知阳性反应片作为阳性对照，以PBS作为一抗用于阴性对照。免疫组化结果按照如下判定：GRP78抗原阳性反应为细胞质和胞膜中出现黄色颗粒，与背景对比，无色、浅黄色、棕黄色和棕褐色分别得0、1、2、3分；
阳性细胞数得分：随机采集10个代表性的视野计算阳性表达率，阳性表达率为阳性细胞数/肿瘤细胞总数×100%，阳性表达率小于5%(-)、5%～25%(+)、26%～50%()及50%以上()分别得分0、1、2、3分。染色强度得分×阳性细胞数得分为0～1分、2～3分、4～5分和≥6分时分别计为阴性(-)、弱阳性(+)、中度阳性()和强阳性()，本研究中将“～”视为高表达，将“-～+”视为低表达。比较PHC组和对照组GRP78表达水平的差异。

1.2.3Western印迹实验 取癌组织、癌旁组织及正常肝脏组织分别置于消毒后的研钵中，一边加入液氮一边研磨成粉末，收集所有粉末移入EP管，加入500 μl RIPA裂解液，冰上孵育约30 min后离心，吸管吸取上清液于-80℃冰箱中保存。取5 μl蛋白样品进行电泳、电转、牛奶封闭，加入一抗GRP78抗体(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)并4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(1∶1 000)孵育1 h。每个条带的蛋白灰度值采用Image J软件检测。组织中GRP78蛋白相对表达水平=GRP78灰度值/β-actin灰度值，重复测量3次，取平均值。

1.2.4临床资料收集 通过住院病历系统收集96例患者性别、年龄、HBsAg、肝硬化、肿瘤直径、肿瘤数目、肿瘤细胞分化程度、术前AFP水平、微血管侵犯、美国癌症联合委员会(AJCC)分期等。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t、χ2检验，方差分析，SNK-q检验，Cox风险比例模型分析，Kaplan-Meier生存分析。

2.1GRP78在PHC患者癌组织中的表达和分布 PHC组GRP78高表达73例，低表达23例；
对照组GRP78高表达9例，低表达36例。与对照组比较，PHC组GRP78高表达率显著升高(χ2=39.542，P<0.001)。在PHC组中，GRP78蛋白阳性信号为黄色、棕黄色或棕褐色颗粒，位于细胞质和胞膜中。见图1。

图1 PHC患者肝癌组织免疫组化染色结果(×200)

2.2PHC患者癌组织中GRP78表达水平和临床-病理特征的关系 PHC患者癌组织中GRP78表达水平与肿瘤直径、肿瘤细胞分化程度、微血管侵犯和AJCC分期显著相关(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 PHC患者癌组织中GRP78表达水平与临床-病理特征的关系(n)

2.3PHC患者癌组织中GRP78蛋白的表达水平 PHC患者癌组织和癌旁组织及正常肝脏组织中GRP78蛋白表达水平分别为1.39±0.45、0.87±0.14和0.26±0.03，3组相比存在显著差异(F=10.726，P=0.010)。与正常肝脏组织比较，PHC患者癌组织和癌旁组织中GRP78蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；
与癌旁组织相比，PHC患者癌组织中GRP78蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图2。

图2 PHC患者癌组织和癌旁组织及组正常肝脏组织中GRP78蛋白表达水平的比较

2.4Cox回归分析 截止到随访时间，本研究中PHC患者死亡39例，生存57例。Cox回归分析结果显示，PHC患者5年生存状态与肿瘤直径、肿瘤细胞分化程度、微血管侵犯、AJCC分期和GRP78表达水平有关(P<0.05)，其中微血管侵犯、AJCC分期和GRP78表达水平是影响PHC患者预后的危险因素(P<0.001)，见表2。

表2 PHC患者生存的单因素和多因素分析

2.5PHC患者癌组织中GRP78的表达水平与5年生存率的关系 GRP78高表达组5年生存率显著低于GRP78低表达组(Log-Rank=4.951，P=0.026)。见图3。

图3 PHC患者Kaplan-Meier生存曲线

2018年，肝癌发病率位于全球癌症发病率第6位，死亡率位于第4位〔1〕，多数患者在确诊时已经发生转移，临床预后较差，故而深入探讨PHC分子生物学发病机制对提高患者预后尤其重要。内质网是蛋白合成及分泌的重要场所之一，对调节细胞信号转导及蛋白生理功能具有显著的作用，机体肝细胞是含有内质网数量最多的体细胞，内质网应激(ERS)是指由于多种原因如炎症、缺氧、钙离子代谢紊乱等从而导致蛋白质折叠、分泌、降解等生理功能的紊乱〔7，8〕，近年来研究认为ERS在肝癌的发病机制中扮演了重要作用〔9，10〕。GRP78属于内质网分子伴侣，主要参与调控蛋白质正常的生理功能，GRP78也被认为属于ESR的标志蛋白之一，GRP78能促进肿瘤细胞的快速增长并抑制其凋亡，与肿瘤细胞的耐药也密切相关〔11，12〕。

本课题组采用免疫组化方法发现PHC患者肝脏癌组织中GRP78表达水平显著升高，进一步通过Western印迹法证实，GRP78蛋白在正常肝脏组织、PHC患者癌旁组织和PHC患者癌组织中表达同样呈现逐渐升高趋势，而既往研究也均证实PHC患者肝癌组织中GRP78表达水平显著升高〔13，14〕，这与本研究结果基本一致；
另外，PHC患者肿瘤体积越大，肿瘤细胞分化程度越低、存在微血管侵犯及AJCC分期越高，GRP78表达水平相对升高，本研究提示GRP78可能与PHC的发生发展及局部侵袭、转移等有关。Ying等〔14〕通过蛋白组学结果发现肝癌患者术后1个月复发患者血清中GRP78自身抗体表达水平显著高于未复发患者，且GRP78自身抗体表达水平与临床分期、门静脉侵犯及转移显著相关。在发病机制上，王月等〔11〕发现GRP78可以通过癌细胞表面的表皮生长因子受体结合，从而促进肿瘤的局部侵袭和转移，并降低肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性；
此外，GRP78也可抑制棕榈酸诱导的肝癌细胞SMMC-7721凋亡过程〔12〕。Luo等〔15〕研究认为，GRP78促进肝癌细胞的增殖可能与活化NF-κB信号通路及上调泛素样蛋白FAT10表达有关。本研究结果提示，PHC患者肝癌组织中GRP78表达水平与预后密切相关。

综上，PHC患者肝癌组织中GRP78表达水平显著上调，GRP78在PHC的发生和发展及肿瘤耐药和免疫逃逸等多方面均起至关重要的作用，当下调GRP78表达后可能会有效抑制肿瘤的生长，在未来靶向阻断GRP78的表达也为肝癌的治疗提供新的见解与思路〔16〕，但仍需更多的基础与临床研究进一步证实。