微生物降解秸秆的研究进展

王仁耀，王娟，李德茂，王乃可，才金玲

(1.天津科技大学 化工与材料学院，天津 300457；
2.中国科学院 天津工业生物技术研究所 天津市工业生物系统与过程工程重点实验室，天津 300308)

中国是世界上农作物秸秆产量最大的国家，秸秆资源量达到全球总量的五分之一[1]。秸秆的处理通常有三种方式：直接田间焚烧、农业化利用、工业化利用。其中，直接田间焚烧会造成大气污染和资源浪费等一系列问题。秸秆的农业化利用目前以还田为主，通过复合菌群加速秸秆腐解，为作物提供养分。工业化利用通过微生物或者水解酶等处理秸秆生产乙醇、沼气、丁酸等。然而，酶解工艺成本过高、条件苛刻，并且效率较低。高效秸秆降解复合菌群具有低成本、高效、降解条件宽泛的特点，对秸秆变废为宝具有重要的意义。

秸秆的农业化和工业化利用都离不开秸秆的降解，而微生物是秸秆降解的关键所在。早期，国内外学者针对秸秆降解的研究更多的体现在筛选单菌株后构建复合菌系，在实验室条件下筛选出具有较高纤维素酶活和半纤维素酶活的单个菌株，然后将菌株进行复配构建复合菌系，继而对复合菌系进行条件优化来达到降解秸秆的目的。但是，目前的研究表明秸秆的降解是不同菌种协同作用的结果，并且在实验室条件下不可培养的微生物在秸秆降解中起到一定的作用[2]。另外，构建的复合菌系容易受到外源微生物的影响，不太符合秸秆还田的实际应用场景。因而，采用限制性培养方法驯化微生物获得一组高效秸秆降解菌群，对农作物秸秆的循环利用和实现可持续发展农业都具有重要的意义。

秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素等组分统称为木质纤维素，在一系列降解酶协同作用下，各组分基质分子内的化学键被依次破坏，致使结构裂解[3]。

纤维素是构成纤维细胞骨架的主要物质，是由葡萄糖分子单体之间通过β-1,4糖苷键连接聚合而成的一种线性长链结构[4]。纤维素酶复合酶系由外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β糖苷酶组成[5]，将纤维素降解为纤维二糖和葡萄糖等小分子还原物质。

半纤维素聚合度较低，呈现非结晶态，主要作为填充物质分布在纤维素大分子之间[4]。木聚糖是组成半纤维素结构框架的最小单体，串联方式为β-1,4糖苷键的相互缔合。木聚糖需要多种酶共同参与降解，首先，木聚糖骨架由于内切 1,4-β-D 木聚糖酶随机切断导致聚合度降低，然后形成的产物木寡糖和木二糖被外切酶β-木糖苷酶分解为木糖。

木质素本质上是由苯丙烷单体聚合而成，并且由大量醚键连接而成的三维网状结构的芳香族物质。木质素的降解以功能酶为主，同时需要多种酶的协同作用，在催化作用下产生不稳定的中间体，继而自发一系列降解反应，生成小分子物质[6]。

另外，纤维素多酶复合体是最近发现的一种主要存在于厌氧微生物中的类似于核糖体的一种细胞器，具有高效的木质纤维素降解能力。其由纤维素酶和脚手架蛋白构成，脚手架蛋白有吸附木质素的纤维素结合域和专一性结合纤维素酶的粘附结构域，从而使纤维素酶在物理空间上聚集[7]。相比于纤维素酶的简单混合，人工体外设计构建的多酶复合体的降解效率可以提高6倍[8]。

自然环境中存在着大量的木质纤维素降解菌，主要通过筛选高效纯培养菌株、人工构建复配菌系和采用限制性培养法驯化复合菌群的方法进行研究。另外，随着基因工程技术的快速发展，导入外源基因，构建工程菌株也受到越来越多的关注与研究[9]。

2.1 降解秸秆的纯菌

自然界中存在着大量可以利用秸秆的微生物，从环境中筛选高效菌株是早期的研究方式。纯培养菌株的筛选一般先对来源于沼液、动物粪便及土壤等环境中的微生物进行培养，而后以秸秆降解相关的酶活力大小为降解能力指标进行复筛得到[10]。目前，细菌、真菌和放线菌等都对木质纤维素表现出一定的降解能力。

细菌中多个菌属都可以降解纤维素和半纤维素，但其降解木质素的报道很少。研究表明细菌在木质素降解中起辅助作用，可以使木质素结构发生改性，但无法使其矿化[11]。细菌生长快、抗逆性强、耐酸碱的特点使其拥有巨大的应用潜力[12]。目前，已被报道的能够降解木质纤维素的细菌主要有噬纤维菌(Cytophaga)、芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)和醋弧菌(Acetivibrio)等[13]。

真菌在木质纤维素的降解中起到主要作用。真菌纤维素酶活性较高，产生的胞外酶种类更为齐全，但是真菌的生长及产酶环境的敏感性限制了其大规模的开发利用。丝状真菌的菌丝可以穿透木质素形成的屏障，由内而外进行木质纤维素的降解。曲霉(Aspergillus)、木霉(Phanerochaete)、丝状真菌(Trichoderma)和白腐真菌(Phanerochaete)等菌属受到的关注最多[14]。

在木质纤维素的降解中，放线菌相比于大部分细菌有更高的酶活；
相比于真菌，其抵御极端环境能力更强。研究报道有效降解木质纤维素的放线菌主要有链霉菌属(Streptomyces)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、小单孢属(Micromonospora)和诺卡氏菌属(Nocardia)等[15]。

利用基因工程重组技术构建高效的基因工程菌，因可实现秸秆的高效降解而受到了越来越多的关注和研究。研究人员将嗜热梭菌的双功能纤维素-木聚糖酶基因和梭状芽孢杆菌的β-葡萄糖苷酶基因重组于毕赤酵母，构建的基因工程菌对于秸秆的降解性能优于两株单菌的单独和复配降解[9]。研究表明利用基因工程技术，以枯草芽孢杆菌作为宿主构建高效表达纤维素多酶复合体的工程菌株，可以实现燕麦干青草的高效降解[16]。

2.2 降解秸秆的菌群

在自然环境下，复合菌群的秸秆降解能力大多优于单菌株。菌群生态适应性强，生理代谢功能丰富，其菌群内部微生物间协同作用是木质纤维素降解的关键所在。目前，复合菌群构建主要有高效单菌株复配和限制性培养法驯化两种方式。

单菌株复配构建菌群周期较短，从环境中筛选出木质纤维素降解单菌进行拮抗性实验，选取无拮抗作用的菌株进行复配，然后对其降解条件优化而获得秸秆降解菌群。李春黎等[17]通过平板初筛和酶活复筛的方式得到的6个菌株复配后，表现出对于烟草秸秆的高效降解，验证了多功能菌株通过协同作用可以显著提高生物质秸秆的降解。但是单菌株复配的方式忽略了不可培养菌在菌群中的作用，大量关于菌群的宏基因组分析表明，不可培养菌对菌群的降解能力影响重大[2]。除此之外，在利用单菌株复配构建复合菌群中，各菌株之间的协同和拮抗作用、各菌株混合比例以及互生和共生菌株的筛选分离仍需要深入研究探索。

利用限制性培养法对菌群进行定向驯化是筛选高效菌群的有效方式，通过对堆肥、瘤胃、厌氧沼液和土壤等环境中的菌群进行限制性培养(主要选取温度和碳源作为限制性条件)，不断提高秸秆降解率而得到一组高效木质纤维素降解菌群。华彬彬等[18]分别在灭菌秸秆和未灭菌秸秆中加入驯化的菌群MC1进行厌氧发酵，5 d后DGGE和PCR图谱表明，所得到的秸秆降解菌群符合秸秆在自然条件下的腐解规律，降解率高，环境适应性强，所含物种丰富，限制性培养方法是构建高效秸秆降解菌群的有效手段。

2.3 影响微生物降解秸秆的因素

秸秆预处理和环境因素都会影响微生物降解秸秆的效果。秸秆预处理的主要目的是去除秸秆硅化层和木质素，破坏纤维素定形区结构，降低结晶度[19]。传统的酸碱预处理方式成本高，污染大，且对水的需求量高，不符合可持续发展的战略要求。目前常将生物、化学、物理预处理方法结合使用用以打破传统预处理方法的局限性，获得较好的秸秆降解效果。因此将各类预处理方法联合起来作用于水稻秸秆以期打破预处理过程中的局限性势在必行。

环境因素对微生物降解秸秆的影响主要体现在两个方面[20]：菌群的物种结构组成与物种演替以及微生物的产酶活性与酶解效率。温度、pH值、发酵方式、碳氮比(C/N)和金属离子等均对降解有影响。Liu等[21]研究发现55 ℃条件下菌群对水稻秸秆的降解效果更好，并且微生物的种类没有发生变化，丰富度有较大的的差异。Wang等[22]研究表明pH会显著影响与木质纤维素降解有关的酶的活性。Kim等[23]研究发现液态发酵时，静置状态利于微生物粘附于秸秆表面而达到更好的降解效果。合适的C/N有助于微生物的生产繁殖，也会影响秸秆降解后腐殖质的质量，初始C/N值在25～35之间被认为是合适的[24]。金属离子影响微生物的产酶活性和菌群结构，Mn2+和木质素降解酶的活性密切相关[25]，Cu2+可以提高微生物群落对聚合物类碳源的转化与利用的能力，对水解酶有激活效应[26]。

对降解条件进行优化也是提高微生物降解秸秆能力的重要途径。在单因素试验的基础上，通过响应面的方法对复合菌群的降解条件进行优化也受到了越来越多的关注。泊翠翠[27]通过响应面分析得出温度和基质含水量是影响固体秸秆基质发酵的关键因素，优化之后使纤维素的降解效率提高2.1倍。

近年来，随着高通量测序技术的低成本、高质量化发展，宏基因组学技术在微生物群落多样性和功能研究中得到广泛利用。微生物多样性测序能同时对优势物种、稀有物种以及非培养物种进行分析，精确解析微生物菌群在种、属水平上的物种组成和丰度情况，是研究微生物菌群多样性及物种演替变化的重要技术手段[28]。

宏基因组学关注微生物群体种群结构、进化分析、功能基因，解析微生物功能与环境之间的关系，挖掘和研究特定功能基因及代谢通路。Kong等[29]采用宏基因组测序技术，研究了平菇发酵液接种玉米芯进行堆肥过程中微生物菌群的动态变化及代谢功能。结果表明，不同堆肥阶段理化性质的变化导致了不同的优势菌株，不同阶段的代谢是由不同的微生物驱动的。Zhong等[30]研究表明不同堆肥阶段的关键微生物有棒状杆菌属、芽孢杆菌属、木犀单胞菌属和非单胞菌属，利用共生分析方法确定了堆肥过程中菌群的六个功能模块。这些模块与温度、pH值、有机质降解和堆肥的成熟度显著相关，宏基因组分析表明，在堆肥过程中，氨基酸、脂肪、能量和异种生物代谢的相对丰度增加。

宏基因组学可以帮助我们发现菌群内部更深层次的机理，对了解微生物之间的协同作用有重要意义。另外，组学分析可以比较菌群在物种组成和功能代谢层面的差异，对于构建高效秸秆降解菌群有重要的指导作用。

利用微生物菌群降解秸秆是目前研究的热点，能够解决秸秆焚烧导致的环境污染和资源浪费问题。通过宏基因组学技术对微生物菌群进行功能解析，能够更加深入的探究秸秆的生物降解机理，阐示多种微生物之间的协同作用，提高秸秆分解速度，缩短秸秆分解周期，这对于秸秆的综合利用至关重要。鉴于此，需要进一步结合宏转录组学分析菌群中微生物的代谢联系，为微生物降解秸秆的实际应用提供更加切实可行的理论依据。