基于形态性状和指标成分的远志遗传多样性分析及综合评价

张 茹 吴昌娟 张丽君 郭淑红 田洪岭,*

(1 山西农业大学生命科学学院，山西 晋中 030600；
2 山西农业大学经济作物研究所，山西 汾阳 032200；
3 山西农业大学农业基因资源研究中心，山西 太原 030000)

远志(PolygalatenuifoliaWilld.)为远志科(Polygalaceae)远志属(PolygalaL.)多年生草本药用植物[1]。远志是我国重要的传统出口药材，始载于《神农本草经》，常年种植面积超过10 000 hm-2，年产量约800 t[2]。远志根的韧皮部作为药用部位，主要指标成分包括皂苷类[3]、酮类、寡糖酯类、生物碱类[4]、香豆素、木质素、黄酮类[5]等，具有安神益智[6]、交通心肾[7]、祛痰和消肿[8]等多种功效。研究远志种质资源的遗传多样性，掌握其分布特点及规律，对于远志种质资源的正确评价、现有资源的充分发掘利用等具有十分重要的意义[9-11]。

近年来，国内外学者先后采用形态数据测定和指标成分含量测定等方法分析了药用植物山药[12]、甜荞[13]、甘草[14]、紫苏[15]、红花[16]等种质资源的遗传多样性。李占林等[17]对远志的根部性状进行了研究，刘超[18]对远志和西伯利亚远志的形态性状进行了测定，秦金山等[19]对远志的花部结构进行了研究，高洁等[20]对远志的根茎叶结构进行了显微观察，王永艳[21]对远志和卵叶远志的指标成分含量进行了测定，但目前暂未有研究同时对远志的形态和指标成分含量进行全面测定。鉴于此，本研究在总结前人经验的基础上，选取山西省、陕西省、河南省、河北省4个省区的42份远志种质资源作为研究对象，所选材料地理覆盖面广，涵盖了我国所有远志主产区，较好地代表了远志资源的自然分布和整个种质资源的遗传多样性；
并于形态水平和指标成分含量水平对42份不同地理来源的远志种质资源进行遗传多样性分析和综合评价，旨在建立综合评价指标，为远志新品种选育和遗传改良提供参考依据。

1.1 试验材料

本试验所用远志材料分别征集于山西省、陕西省、河北省、河南省农户，并种植于山西农业大学经济作物研究所药用植物资源圃内(简称经作所资源圃)。经作所资源圃位于汾阳市东南方(37°14′40″N，111°47′2″E)，为新垦树林地，土质为壤土，肥力中上等，排灌方便；
平均海拔750 m，全年平均气温9.7℃，积温 3 400～3 700℃， 全年平均日照时数2 601.3 h，无霜期175 d左右，年均降水量450～500 mm，降水主要分布在7—9月。土壤类型为石灰性褐土，供试土壤碱解氮含量55.08 mg·kg-1，有效磷含量17.5 mg·kg-1， 速效钾含量159.45 mg·kg-1，有机质含量16.24 g·kg-1，pH值8.3。本试验所用材料均为三年生远志，具体材料来源信息见表1。

表1 远志样品信息Table 1 Information of Polygala tenuifolia

1.2 远志种质资源形态性状遗传多样性研究

对远志采用五点取样法，选择每份种质的5株植株，对形态性状数据进行测定并记录。具体的形态性状指标包括株高、茎分支、鲜根长、鲜根粗、根分支、鲜根重、木芯粗、根皮鲜重、木芯鲜重、根皮干重、木芯干重、叶色、花色、根皮颜色。为便于数量化和统计分析，质量性状予以赋值，见表2。

表2 质量性状赋值表Table 2 Assignment table of quality traits

1.3 远志种质资源指标成分含量遗传多样性研究

1.4 数据统计与分析方法

试验数据采用Excel 2010进行统计，计算供试材料各指标的总体平均值(X)、标准差(standard deviation，SD)、变异系数(coefficient of variation，CV)。利用Shannon-Wiener遗传多样性指数H′来评价遗传多样性[23]。

利用SPSS 21软件分别对形态性状和指标成分含量进行数据统计分析及聚类分析[24]、主成分分析[25]、相关性分析[26]、主成分分析[27]，利用隶属函数计算综合评价值F，再结合逐步回归分析筛选远志资源综合评价指标。

2.1 变异及遗传多样性指数分析

2.1.1 形态性状变异及遗传多样性指数分析 由表3可知，远志形态性状的变异系数变化范围较大，其中根长变异系数最小，为13.99%，根皮颜色变异系数最大，为48.11%。这些指标中，株高、根长、根粗、木芯粗的变异系数较低，在13%～20%之间，依次为根长<根粗<株高<木芯粗，其余性状变异系数均明显较高，介于32%～49%之间，依次为根皮重<根重<木芯重<叶色<花色<根分支数<茎分支数<根皮颜色。株高遗传多样指数最大，为1.654 7，叶色的遗传多样性指数最小，为0.780 3。3个质量性状的遗传多样性指数处于0.7～1.0之间，依次为叶色<根皮颜色<花色，均低于数量性状的遗传多样性指数(1.2～1.7)，依次为根长<根粗<根分支数<木芯重<根皮重<茎分支数<根重<木芯粗<株高。形态性状变异系数平均为32.42%，遗传多样性指数平均为1.292 1。

表3 远志形态性状测定统计Table 3 Determination of morphological traits of Polygala tenuifolia

2.1.2 指标成分含量变异及遗传多样性指数分析 由表4可知，3，6′-二芥子酰基蔗糖含量的变异系数最大，为29.54%，变异幅度为2.52～9.61 mg·g-1，其次是远志酮Ⅲ，为25.31%，变异幅度为0.84～2.64 mg·g-1， 细叶远志皂苷的变异系数最小，为19.75%，变异幅度为13.46～36.28 mg·g-1。3个指标成分含量的遗传多样性指数与变异系数变化一致，差异明显。最高为3，6′-二芥子酰基蔗糖，1.418 0，其次是远志酮Ⅲ，为1.201 9，最低是细叶远志皂苷，为0.987 1。指标成分含量变异系数平均为24.87%，遗传多样性指数平均为1.202 3。

表4 远志指标成分含量测定统计Table 4 Determination of the content of medicinal ingredients of Polygala tenuifolia

2.2 远志形态性状与指标成分含量相关性分析

对远志形态性状和指标成分的相关性进行统计和分析(表5)，结果表明，远志酮Ⅲ含量与花色深度呈极显著正相关，与株高呈显著正相关，与木芯粗呈极显著负相关；
3，6′-二芥子酰基蔗糖含量与细叶远志皂苷含量呈显著正相关，与株高呈极显著负相关；
细叶远志皂苷含量与茎分支数呈显著负相关。

2.3 形态性状与指标成分含量结合主成分分析

对远志种质资源形态性状和指标成分进行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，将15个指标简化为4个因子，累计贡献率达67.764%，包含了形态性状和指标成分的绝大部分信息(表6)。第1主成分特征值为5.024，贡献率为33.490%，解释了根重、根皮重、木芯粗、木芯重、根粗、根分支数的信息，此类因子均为根部形态性状相关因子。第2主成分特征值为1.983，贡献率为13.221%，解释了细叶远志皂苷、花色、远志酮Ⅲ和叶色4个指标。第3主成分特征值为1.834，贡献率为12.225%，解释了株高和3，6′-二芥子酰基蔗糖2个指标。第4主成分特征值为1.324，贡献率为8.827%，解释了根皮颜色和根长2个指标。

表6 远志形态性状与指标成分含量主成分分析Table 6 Principal analysis between morphological traits and the content of medicinal ingredients of Polygala tenuifolia samples

2.4 聚类分析

2.4.1 形态性状聚类分析 基于形态性状对远志进行聚类分析，结果如图1所示。在欧氏距离为15时，将远志种质资源分为三大类，类群Ⅰ包含16份远志种质资源，主要来源于山西省吕梁市、晋中市、临汾市、运城市，陕西省渭南市、榆林市；
类群Ⅱ包含12份种质资源，主要来源于山西省临汾市、运城市，河南省洛阳市；
类群Ⅲ包含14份种质资源，主要来源于山西省临汾市、运城市，河南省洛阳市，河北省保定市、衡水市、邢台市。由表7可知，类群Ⅰ表现为植株矮、根茎分支少、根短且细、根和木芯重量小；
类群Ⅱ表现为植株高、根长且粗、根重量大、根皮颜色深；
类群Ⅲ表现为根茎分支多、叶色花色深。

表7 远志形态性状聚类分析Table 7 Dendrogram analysis from the morphological traits of Polygala tenuifolia samples

图1 远志形态性状聚类Fig.1 Dendrogram based on the morphological traits of Polygala tenuifolia samples

2.4.2 指标成分含量聚类分析 根据指标成分含量进行聚类分析，结果如图2所示。这些材料被明显分为三类，类群Ⅰ包含16份种质资源，主要来源于山西省吕梁市、晋中市、临汾市、运城市，陕西省渭南市、榆林市；
类群Ⅱ包含17份种质资源，主要来源于山西省临汾市、运城市，河北省衡水市、邢台市；
类群Ⅲ包含9份远志种质资源，主要来源于河南省洛阳市，河北省保定市、邢台市、衡水市。由表8可知，类群Ⅰ远志酮Ⅲ含量最高，类群Ⅱ细叶远志皂苷和3，6′-二芥子酰基蔗糖含量最高。

图2 远志指标成分含量聚类Fig.2 Dendrogram based on the content of medicinal ingredients of Polygala tenuifolia samples

2.5 综合评价

对42份远志资源的12个形态性状值和3个指标性成分含量值进行标准化处理，求得各种质的4个主成分得分，将4个主成分进行归一化处理，计算各成分权重系数分别为0.446、0.176、0.163、0.118，最后求得每份种质材料的综合得分F值，进而对42份远志种质资源进行综合评价，F值的变化范围在-1.15～1.23之间。根据F值进行排序，其中14、1、11、19、23、38、3和24号8份种质的综合得分大于0.5，可作为优异育种资源加以利用。来自山西省临汾市的14号种质的F值最高，为1.23，来自河南省洛阳市的32号种质的F值最低，为-1.15。

表8 远志指标成分含量聚类分析Table 8 Dendrogram analysis based on the contents of medicinal ingredients of Polygala tenuifolia samples

对形态性状值和指标性成分含量值与综合得分(F值)进行相关性分析(表9)，结果表明，除了株高、叶色和根皮颜色外，其余指标与F值均有相关性，其中根分支数、根长、根粗、木芯粗、根重、根皮重、木芯重、花色、远志酮Ⅲ含量和3，6′-二芥子酰基蔗糖含量与F值呈极显著相关性。以综合评价值F与12个形态性状值和3个指标性成分含量值构建最优回归方程：Y=0.028X2+0.126X3+0.196X4+0.104X9+0.457X11+0.419X13+0.041X14-2.778。X2、X3、X4、X9、X11、X13和X14分别代表茎分支数、叶色、花色、根重、木芯重、远志酮Ⅲ含量和3，6′-二芥子酰基蔗糖含量。式中，方程相关系数r和决定系数R2分别为0.986和0.972，表明7个自变量可决定F值总变异的97.20%，F值为181.316。由回归方程可知，7个指标可以用于远志种质综合评价，作为筛选远志优异种质的关键性指标。

表9 形态性状值和指标性成分含量值与综合得分(F值)的相关系数Table 9 Correlation coefficients between morphological character value, index component content value and F value

本研究以征集到的山西省、陕西省、河北省、河南省远志资源为样本，对其形态性状和指标成分含量进行测定，并对其进行变异系数及遗传多样性指数分析、聚类分析、主成分分析、相关性分析。变异系数及遗传多样性指数分析结果显示，4个主产区远志资源在形态性状水平存在明显差异，且其差异呈不均匀分布，变异系数平均为32.42%，遗传多样性指数平均为1.292 1，这与李占林等[17]和刘超[18]关于远志形态性状的研究结果基本一致。4个产区远志资源在指标成分含量水平的变异系数和遗传多样性指数的平均值分别为24.87%和1.202 3，说明在形态性状水平的遗传多样性大于指标成分水平的遗传多样性。

研究结果还表明远志种质资源指标成分含量与部分形态性状有一定的相关性：远志酮Ⅲ含量和花色呈极显著正相关，与株高呈显著正相关，与木芯粗呈极显著负相关；
3，6′-二芥子酰基蔗糖含量与细叶远志皂苷含量呈显著正相关，与株高呈极显著负相关；
细叶远志皂苷含量与茎分支数呈显著负相关。王丹丹等[28]对3个指标成分含量与6个不同农艺性状特征包括株高、根直径、根长、第一侧根分叉高度、侧根数、根重进行相关性研究，结果表明细叶远志皂苷含量与6个农艺性状无明显相关性；
远志酮Ⅲ与根长呈负相关，与侧根数呈正相关；
3，6′-二芥子酰基蔗糖与根长呈正相关。张琳等[29]对3个指标成分含量与3个形态性状特征包括根长、根粗、株高进行相关性研究，结果表明远志酮Ⅲ与株高之间存在极显著相关关系，细叶远志皂苷与根粗之间存在极显著相关性，3，6′-二芥子酰基蔗糖与3个性状指标无相关性。本研究相关性研究结果与上述结果有差异，可能与远志种质资源材料种类选择的不同有关。

对远志种质资源形态性状和指标成分进行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，将15个指标简化为4个因子，累计贡献率达67.764%，包含了形态性状和指标成分的大部分信息。其中第2、第3主成分包含指标成分和形态性状因子，反映远志的质量。第1、第4主成分为根部形态形状相关因子，反映远志的产量。主成分4个因子包含了大部分信息量，且各指标间具有一定的相关关系，表明形态性状与指标成分含量对主成分结果均有一定的影响。

本研究发现，形态性状水平和指标成分含量水平的聚类分析结果不一致，虽然两个水平的聚类分析都将远志种质资源分为三大类群，但每个类群包含种质资源的类型和数量不相同。两个水平中，山西临汾市和运城市均存在于每个类群，可能是由于临汾市和运城市作为山西远志的主产区，本次试验采用的样本量较大。在两个水平中均为第Ⅱ类群中临汾市和运城市种质占据主要部分，且其在形态性状方面根的长度和重量均大于其他类群，在指标成分含量水平，三个指标成分含量同样均达到药典的标准。总体来说，地理位置接近的区域其遗传距离也较近。但各个地区并未单一地按照地域聚集于一个类群，这可能与远志种质资源间存在着相互引种有关。

本研究利用综合评价F值进行远志种质资源评价，筛选出8份优良种质，其中有2份来自山西南部的临汾市，3份来自山西南部的运城市，2份来自山西中部的吕梁市，1份来自河北中部的保定市，这些种质可以作为参试区优异种质进行进一步研究。以综合评价值F与12个形态性状值和3个指标性成分含量值构建最优回归方程，筛选到茎分支数、叶色、花色、根重、木芯重、远志酮Ⅲ含量和3，6′-二芥子酰基蔗糖含量7个关键性指标作为远志综合评价指标，为远志种质资源评价和新品种选育提供了参考依据。本研究也存在一定的局限性，仍需结合分子水平进行评价鉴定，后续将结合简单重复间序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)标记进行群体结构和亲缘关系分析，以拓展远志遗传多样性研究的宽度和深度。

参试远志种质资源主要形态性状和指标成分的变异幅度较大，遗传多样性丰富；
茎分支数、叶色、花色、根重、木芯重、远志酮Ⅲ含量和3，6′-二芥子酰基蔗糖含量7个指标可作为核心种质评价的综合指标。本研究从42份种质资源中筛选出8份综合表现良好的优异单株，可用于进一步开发和利用。