大黄中总鞣质的提取方法研究

刘 佳，黄思洋，陈钰沁，朱艳玲，赵明智，付娟姬，杨伶俐

(1.昆明医科大学 海源学院，云南 昆明 650101；
2．昆药集团血塞通药业股份有限公司，云南 文山 663400；

3．昆明医科大学第一附属医院 科教部，云南 昆明 650000)

大黄(RheumoffcinaleBaill.)的茎、根除去杂质及外皮，切碎，进行干燥后即可药用.大黄有较多的药理作用，富含蒽醌类、蒽酮类、总鞣质等化学成分，具有良好的致泻、止痛、抗肿瘤、抗衰老、解毒等功效，常用于临床治疗[1-2].

许多学者[1-4]对大黄的研究主要集中于蒽醌类化合物，因蒽醌类化合物具有一定的抗菌活性，并有致泻作用.而鞣质是大黄中重要的活性成分之一，别名单宁，相对分子质量为500～3 000，主要分为水解型和缩合型，其中没食子酸和d-儿茶素是鞣质的主要单体成分，具有一定的药理活性[5-6].此外，鞣质是一类结构较复杂的多元酚类化合物，在植物界分布广泛，约70%以上的生药中含有鞣质类化合物[7].研究[8]发现，鞣质化合物数量多、类型广，具有广泛的药理活性.据报道[7,9-13]，鞣质具有抗心脑血管疾病、抗高血压、降血脂、降血糖等作用.

鞣质的提取方法主要有超声波辅助提取、微波提取、浸渍法、水煎法、加压提取和超临界流体萃取等，其中：水煎法也称为煎煮法，是一种常见的浸提方法，该方法方便且经济，但对于煎煮时间、浸泡时间等没有一个最佳标准，导致提取的有效成分效果不明显，且杂质较多，水煎液易变质[14].浸渍法是在容器中装入生药粗粉，再利用溶剂(如水和乙醇等)浸渍药材使其活性成分得到溶解.该方法特别适用于提取有效成分易破坏的药材、黏性药材、芳香性药材和非结构化医药产品.此外，浸渍法根据提取温度分为热、温、冷3种方法，按浸渍次数又分为轻和重2种方法.由于该方法操作时间长，且很难完全浸渍出活性成分，因此对于价值高的药材、毒性药材等都不宜采用此方法.而超声波辅助提取法是借助超声波从植物中提取活性成分，其原理是破坏细胞膜，用超声波来连续震荡提取物，使活性成分得到溶解并释放出来，同时产生热量以保持水温，使原料被水溶解.超声波辅助提取法可缩短提取时间，提高活性成分的提取率及原料的使用率.因此，本研究拟采用超声波辅助提取法提取大黄中的总鞣质，并通过单因素实验和正交实验，对提取方法进行探讨，以期筛选出提取大黄中总鞣质的最佳方法.

1.1 实验仪器

UV2550紫外可见光光度计(上海美普达仪器有限公司)；
SI204型电子天平(上海赞维衡器有限公司)；
AG133型电子天平(深圳市盛美仪器有限公司)；
SHBIII循环水式多用真空泵(郑州科秦实验设备有限公司)；
SK2200H超声仪(苏州创惠电子有限公司)；
Direct-QTM5超纯水仪(上海砾鼎水处理设备有限公司)；
电热恒温水浴锅(FANAI仪器有限公司)；
101A3型干燥箱(上海荣计达仪器科技有限公司)；
JZL型中药粉碎机(广州市赛豪机械有限公司).

1.2 试药和样品

大黄药材(购自北京同仁堂西安市西大街店)；
没食子酸对照品(上海鼓臣生物技术有限公司)；
无水碳酸钠、干酪素、乙醇(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 提取工艺

称取一定量的大黄药材，粉碎后过筛，再精密称取10.00 g的大黄粉末，放入10 mL容量瓶中，并加入体积分数为60%的乙醇，超声提取60 min，并用乙醇补足，静置过夜，取上清液，得到质量浓度为1 g/mL的生药.

1.3.2 供试品溶液制备

量取1.3.1项下的适量大黄提取液至250 mL的棕色容量瓶中，并加体积分数为60%的乙醇 150 mL，静置过夜，超声处理10 min，冷却并加乙醇稀释至刻度，轻轻摇动容量瓶，使其混合均匀.充分静置后过滤，弃初滤液，精密量取10 mL置于100 mL的容量瓶中，再加入体积分数为60%的乙醇稀释至刻度，轻轻摇晃容量瓶，让其均匀混合，得供试品溶液.

1.3.3 对照品溶液制备

精密称取50 mg的没石子酸对照品,然后置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度.精密量取该溶液5 mL置于50 mL的棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得.

1.3.4 检测波长选择

取适量的没食子酸对照品置于50 mL的棕色瓶中，加入1 mL的磷钼钨酸试液及20 mL的水，最后用29%碳酸钠溶液定容至刻度，放置阴凉处静置15 min，选择体积分数为60%的乙醇溶液作为参照物，扫描波长范围选定在200～800 nm处，得最大吸收波长为760 nm.

1.3.5 标准曲线制作

分别精密量取1.3.3项下制备的对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于6个 25 mL 的棕色容量瓶中，然后顺次加入1 mL的磷钼钨酸试液，并分别加入11.5，11.0，10.0，9.0，8.0，7.0 mL的水，再用29%碳酸钠溶液定容至刻度，轻轻摇晃容量瓶，使其混合均匀，最后静置15 min.用空白溶液作参比溶液，测定 760 nm 处的吸光度值.以吸光度值为纵坐标，溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线.

1.3.6 总鞣质含量的测定

1)总酚含量的测定.将4.0 mL供试品溶液倒进50 mL洁净的棕色量瓶中，采用与1.3.2项下相同方法则可得到各种供试品溶液，在760 nm处测定吸光度值，将吸光度值代人回归方程，通过计算即可得到溶液里的总酚含量.

2)不被吸附多酚含量的测定.在100 mL锥形瓶中加入0.6 g磨成细粉的干酪素和25 mL于1.3.2项下所制备的溶液放入30 ℃恒温水浴锅中 1 h，摇匀，水浴保温后拿出，放冷至室温，混合均匀静置，过滤弃初滤液，精密量取4 mL续滤液，倒入50 mL洁净的棕色量瓶中，使用1.3.4项下方式处理，于 760 nm 波长处测定吸光度值，代入回归方程式，通过计算即可得到不被吸附的多酚含量.

3)总鞣质含量为：总鞣质含量=总酚含量-不被吸附的多酚含量.

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度考察

精密量取没食子酸对照品溶液，于760 nm波长处，连续6次测定吸光度值.通过计算得到RSD为0.263%，表明仪器的精密度良好.

2.1.2 稳定性考察

取1.3.2项下制备的供试品溶液6份，在 760 nm 波长处，于0，1，2，4，8，12，24 h分别测定吸光度值.通过计算得到RSD为0.216%，表明在24 h内，该样品稳定性良好.

2.1.3 重复性考察

取6个样品，按1.3.2项下制备的供试品溶液，在波长760 nm处测定吸收度值.通过计算得到RSD为0.132%，表明重复性良好.

2.1.4 线性关系考察

根据数据绘制工作曲线，横坐标和纵坐标分别为没食子酸质量浓度(mg/mL)和吸光度值(A)，得到回归方程，Y=98.959x-0.011 3(R2=0.999 6)，详见图1.

图1 没食子酸工作曲线

2.1.5 加样回收率

精密称取9份已知样品各0.1 g，并分别加入相同质量的没食子酸对照品.根据1.3.2项下制备的供试品溶液，在760 nm波长处测定吸光度值，并计算回收率，得到平均回收率为99.13%，RSD为0.398%，回收率比较高，详见表1.

表1 加样回收率实验结果(n=9)

2.2 单因素实验考察

2.2.1 溶剂体积分数筛选

取5份各8 g的大黄粉末，精密称定.然后分别加入15倍量体积分数为20%，40%，60%，80%，100%的乙醇，超声提取60 min.显色后在波长760 nm处测定吸光度值,结果见表2.

2.2.2 提取时间筛选

分别取5份各8 g的大黄粉末，精密称定.然后再加入15倍量体积分数为60%的乙醇溶液，分别超声提取20，40，60，80，100 min.显色后在波长760 nm处测定其吸光度值，提取时间筛选结果见表3.

表2 溶剂体积分数对总鞣质提取率的影响

表3 提取时间对总鞣质提取率的影响

2.2.3 固液比筛选

取5份各8 g的大黄粉末，精密称定.加入5，10，15，20，25倍体积分数为60%的乙醇溶液，超声提取80 min.显色后在波长760 nm处测定吸光度值，结果见表4.

2.2.4 正交实验

将单因素实验的测定结果进行比对，完成正交实验的设计，详见表5.在实验过程中将其提取率作为指标进行实验，共进行3次，然后对3次测定的数值进行计算，结果见表6[15].

通过极差分析比较，在上述影响因素中，对提取率影响最大的为A，其次为C，影响率最小的是B.因此,最优提取工艺为A2B3C1，换言之，当乙醇体积分数为60%、提取时间为 100 min、溶剂用量为15倍时，大黄中总鞣质的提取率最高.

表4 固液比对总鞣质提取率的影响

表5 因素水平表(n=3)

表6 正交实验结果

为了对提取工艺的可靠性进行验证，使用相同的提取工艺，按照样品制备方法平行制备3 份样品，则得到平均提取率为1.395%，说明本提取工艺稳定、可靠，可用于大黄中总鞣质的提取.

本研究使用乙醇为溶剂，并采用超声波辅助提取法提取大黄中的总鞣质，该方法相较使用溶剂为水的煎煮法、浸渍法、渗漏法等提取方法而言，不仅提取效率明显高于其他方法，而且对有效成分的结构破坏较小，可避免蒽醌类衍生物由于热不稳定性而增加溶出物被破坏的可能性[16-18].

本研究着重对大黄中总鞣质的提取方法进行了探讨，并通过单因素实验探究了溶剂体积分数、提取时间和溶剂用量3个主要因素对于产物提取率的影响，结果表明，当乙醇体积分数为60%、提取时间为100 min、溶剂用量为15倍时，大黄中总鞣质的提取率最高.