变异链球菌糖转运及其调控机制的研究进展

龚涛 李雨庆 周学东

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医学院 成都 610041

龋病是最常见的口腔感染性疾病之一，具有发病率高，治疗率低，再治疗率高等特点，严重影响人类口腔和全身健康[1-3]。第四次全国口腔健康流行病学调查[4]结果显示，中国居民整体患龋率普遍偏高，如35～44岁年龄组的恒牙患龋率为89.0%，55～64岁年龄组的恒牙患龋率为95.6%，65～74岁年龄组的恒牙患龋率高达98.0%。现代龋病病因学说认为，龋病是发生于牙体硬组织，由微生物代谢产酸所导致的慢性感染性疾病[5]。牙齿表面的微生物和细胞外基质往往形成多种生物膜群落，正常情况下宿主与生物膜之间处于健康的动态平衡状态[6]。当宿主长期摄入高糖饮食时，微生物代谢可产生多种细胞外基质和酸性代谢物，胞外基质的产生可促进生物膜的形成，同时生物膜内微生物多样性减少，而产酸和耐酸性微生物增加，即生物膜的微生态平衡被打破，导致生物膜与牙齿表面接触部位局部pH降低，最终引发牙体硬组织脱矿[6-8]。

变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是主要致龋微生物之一，其致龋毒力包括产酸耐酸性、对牙面的黏附作用、合成细胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）和对环境应激的适应能力[9-10]。有学者发现，S.mutans不仅能够代谢碳水化合物（如蔗糖）产生有机酸致使牙齿脱矿，还能够合成水不溶性胞外多糖。EPS不仅可作为微生物代谢的营养物质，也能为S.mutans及其他微生物的定植和集聚提供黏附位点，促进牙菌斑生物膜的形成。研究[11-12]表明，S.mutans毒力因子的形成与其糖类转运和代谢相关，而糖类的转运和代谢又受到多种因子的调控。因此，本文主要综述S.mutans糖转运的研究进展，尤其关注糖转运方式和调控糖转运的各种调节因子，以期为口腔中其他细菌糖转运相关机制研究提供参考。

糖类是细菌主要的碳源，细菌摄入后可用于糖酵解途径产生腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），合成各种细胞组分（如肽聚糖、脂肪酸、核酸）以及细胞内多糖（intercellular polysaccharide，IPS）。细菌摄入糖的类型因其种类不同而存在较大差异，如S.mutans可利用棉子糖作为碳源，而其他链球菌则不能[13]。S.mutans摄入糖的种类可大致分为单糖（葡萄糖、果糖和半乳糖），二糖（蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖），三糖（棉子糖）和氨基糖（葡萄糖胺和N-乙酰葡糖胺）等[11]。研究[11,14]表明，S.mutans转运糖的方式主要有2种：磷酸转移酶系统（phosphotransferase system，PTS）和ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运系统。

1.1 PTS

PTS又称为磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）依赖性糖磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system，PEP-PTS），是S.mutans摄入糖类最主要的方式。截止目前，已报道的PEP-PTS系统结构基本相似，主要包含2个胞质磷酸转移酶：酶Ⅰ（enzymeⅠ，EⅠ）；
组氨酸磷酸载体蛋白（histidinecontaining phosphocarrier protein，HPr）以及依赖于物种的数目可变的糖结合特异性酶Ⅱ（enzymeⅡ，EⅡ）复合物，包括EⅡA、EⅡB、EⅡC和EⅡD[15]。如在摄入葡萄糖时，葡萄糖先与EII特异性结合并被转运至细胞膜内，同时EⅠ磷酸化后再将磷酸基团传递给HPr，形成的P-HPr随即磷酸化葡萄糖形成葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，Glu-6P），最后Glu-6P进入糖酵解途径[11,15]。在S.mutansUA159中含有14种PTS，其中特异性EⅡ约15种，表明它可转运多种糖类满足自身代谢需求并适应复杂多变的环境[16-17]。

1.2 ABC转运系统

相比PTS，ABC转运系统转运糖类的特异性较低，但能够转运多种不同类型的多糖[11]。ABC转运蛋白结构中均有ABC存在，其通过水解ATP释放的能量来对底物进行跨膜转运。S.mutansUA159基因组注释表明含有4种ABC转运系统[14]，而目前结构相似且研究较为清楚的是：MsmEFGK和MalXFGK[18]。ABC转运系统含有4个结构域（图1）：一个绑定多糖的膜外结合蛋白（MsmE/MalX），2个跨膜蛋白（MsmF/MalF和MsmG/MalG）和一个位于胞内结合ATP的亚基（MsmK/MalK），即当膜外蛋白MsmE结合多糖底物后并将其传给跨膜通道蛋白MsmF和MsmG，同时将信号传递给膜内蛋白MsmK使其水解ATP供能，促使底物进入胞内[18-19]。研究[18]发现，MsmEFGK主要转运蜜二糖、棉子糖、水苏糖、异麦芽糖和异麦芽三糖等，而MalXFGK主要转运麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖和麦芽七糖等。总之，ABC转运系统扩大了S.mutans摄入糖的范围，提高自身的适应能力。

图1 PTS和ABC转运系统Fig 1 PTS and ABC transporter

2.1 转录激活子

S.mutansUA159菌株海藻糖操纵子中TreR作为转录激活子调控treA和treB表达以响应对海藻糖的利用[20]。研究[20]还发现，TreR的缺失不仅影响氧耐受和酸耐受能力，同时也极大地降低变链素的产生，导致种间竞争能力下降。此外，CelR也作为转录激活子调控S.mutans对纤维二糖的利用[21]；
StsR失活引起多个PTS操纵子基因下调，导致糖转运能力严重下降，并影响EPS合成和生物膜的形成[22]。这些结果表明，转录因子可直接参与调控PTS转运糖的能力，同时也能影响其毒力因子的形成。

2.2 转录抑制子

S.mutansUA159菌株中NigR作为转录抑制子结合至启动子区域，与RNA聚合酶形成空间阻遏并阻止下游基因的转录，抑制代谢蔗糖形成生物膜的操纵子PTSBio的表达，进而影响糖转运和生物膜形成[23]。研究[24-26]发现，分解代谢物控制蛋白（catabolite control protein A，CcpA）、FruR和EⅡMan都可抑制manLMN操纵子（主要转运葡萄糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖胺和N-乙酰葡糖胺）的表达；
同时，CcpA和FruR也可阻遏fruRKI操纵子（主要转运果糖）的转录，而fruR和fruK的缺失可影响S.mutans碳水化合物代谢以及生物膜的形成[17]。以上研究结果表明，部分转录因子不仅可作为负调节子阻止糖类的转运，而且单个转录因子还能同时调节多个糖转运操纵子转录，暗示着S.mutans拥有精密而又复杂的糖转运调控网络。

2.3 双组分系统

FruA是S.mutans果聚糖水解酶，可分解果聚糖为果糖被其利用，而果聚糖的存在又可激活fruA的表达[27]。研究[28]发现，在果糖存在的情况下，LevQRST双组分系统响应果糖并激活fruA和levDEFG（即PTS的EⅡlev组分）转录。一方面，大量表达的FruA将胞外的果聚糖分解为果糖，同时将转运更多的胞外果糖至细胞内。另一方面，FruA的积累促使EⅡlev和EⅡFru反馈调节fruA并抑制它的表达；
同时，胞内的果糖增加也会激活碳分解代谢物阻遏（carbon catabolite repression，CCR）系统去关闭fruA的转录。此外，果聚糖可作为S.mutans的胞外储能多糖，当缺乏速效碳源时可利用该途径摄入果糖为细胞提供碳源，以应对饥饿胁迫并提高环境适应能力。

2.4 CCR

CCR是指微生物在混合碳源发酵时优先利用速效碳源（通常为葡萄糖），且该碳源的代谢产物会抑制其他非速效碳源代谢相关的基因表达和蛋白活性，从而影响非速效碳源利用的现象[29-30]。在低GC含量（即鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比例）的革兰阳性菌中，CCR的关键调控因子为CcpA[29]。如S.mutans以葡萄糖等为速效碳源时，胞内ATP和果糖-1,6-二磷酸（fructose-1,6-bisphosphate，FBP）含量升高激活HPrK/P的活性，将HPr丝氨酸残基磷酸化形成P-(Ser)-HPr，随即与转录因子CcpA形成复合物直接结合非速效碳源基因的代谢响应位点分解代谢反应元件（catabolite response elements，CRE），从而激活或阻遏非速效碳源基因的转录，然而CcpA的缺失并不会导致CCR功能完全丧失[31]。研究[32]发现，CcpA不仅调节S.mutans碳水化合物代谢以及毒力因子的表达，同时在其许多基因的启动子区域可检测到大量的潜在CcpA结合位点cre，暗示CcpA还有可能调控其他生理功能。如CcpA可直接结合lrgAB和cidAB操纵子的启动子区域，进而调控葡萄糖摄取，细胞自溶，基因感受态，生物膜形成和应激响应等[33]。当以葡萄糖、果糖或甘露醇作为单一碳源时，敲除CcpA虽然影响S.mutans的生长，却增强了其糖酵解能力、IPS的储存和酸耐受能力[34]。然而，IPS的储存在细菌长久定植（或持留）和毒力因子形成方面具有重要作用[35]，进一步表明CcpA可影响S.mutans碳源的利用和毒力因子的形成。此外，CcpA也可调节多种EⅡ渗透酶的表达来间接影响非速效糖摄入的能力[31,36]。因此，S.mutans以CCR这种方式快速且无缝地调节碳水化合物的摄取和代谢途径，从而更加高效地响应口腔内不断变化的复杂环境。

S.mutans糖类的摄入与其毒力因子的形成有着非常密切的联系，其摄入糖类的方式主要包括PTS系统和ABC转运系统。它们不仅可以运输和磷酸化碳水化合物，而且可以执行与碳代谢有关的调节功能以及影响毒力因子的形成。口腔是一个持续变化的复杂环境，S.mutans拥有多种转运糖类的方式，以维持新陈代谢和适应多变复杂的环境。未来的工作将致力于糖转运的机制研究，寻找更多调控糖类转运的关键因子，以此作为抗龋靶点阻止糖类的转运并抑制毒力因子的形成，从而为龋病防治或治疗提供新策略。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。