鸭圆环病毒编码蛋白功能研究进展

姚鑫炎，吕志航，张玉倩，张雪莲，郭莎莎

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528231）

鸭圆环病毒（duck circovirus,DuCV）属于圆环病毒科，圆环病毒属，同属的成员还包括猪圆环病毒（porcine circovirus,PCV）、鹅圆环病毒（goose circovirus,GoCV）、鸽圆环病毒（pigeon circovirus,PiCV）和鹦鹉喙羽病病毒（beak and feather diseasevirus,BFDV）等。DuCV是一种环状DNA病毒，基因组长约1.8 kb，分别编码Rep蛋白、Cap蛋白及ORF3蛋白。目前根据Cap蛋白序列和全基因组序列系统发育树可分为DuCV-1和DuCV-2两个基因型，每个基因型又可分为不同的基因亚型。就当今的流行情况来看，DuCV-1比DuCV-2流行范围要广泛，同时，同一基因型的不同基因亚型流行情况又不同，并且不同基因型或基因亚型存在重组。目前，鸭圆环病毒已广泛流行于养鸭业，严重危害了养鸭业的健康发展。

鸭圆环病毒病（duck circovirus disease,DuCVD）是由DuCV引起的鸭羽毛发育不良、生长发育迟缓和消瘦贫血等临床症状的免疫抑制性传染病[1]。各日龄和品种鸭均易感，DuCV感染后的鸭子各免疫系统表现为出血、变性、坏死及淋巴细胞严重减少[2]，造成机体免疫功能下降，使得机体继发感染或多重感染的概率大大提高。在2003年，DuCV由Hattermann K等[3]在德国首次报道，随后在匈牙利、美国、韩国、台湾和中国等陆续报道该病毒感染病例[4-8]。近十几年来，我国各省鸭感染圆环病毒的病例不断被报道，刘少宁[9]对我国养鸭集中省份的36个鸭群采集343只病、死鸭的病料，结果显示，病、死鸭中DuCV的个体阳性率为81.63%（280/343），群体阳性率为94.4%（34/36）。Liu等[10]对中国南方3个省4个不同品种的鸭进行检测，结果显示总体阳性率为36.91%，且大于4周龄的鸭子比小日龄的更易感。白冰等[11]对2016—2020年广东地区鸭圆环病毒病流行调查结果显示，DuCV阳性检出率为23.18%（211/910），其中2019年第3季度检出率为34.61%。同时，DuCV与细小病毒、坦布苏病毒及鸭疫里默氏杆菌等病原菌混合感染病例趋势的不断增高[12-14]，严重威胁了我国养鸭业的健康发展。由于当今鸭圆环病毒仍缺乏合适的宿主细胞系，且该病毒病尚无较好的预防措施，临床感染率又较高，因此，深入研究DuCV的基因组结构和编码蛋白功能有助于对该病的致病机理及疫苗研制的研究，以期为DuCV的深入研究及该病的科学防控提供借鉴。

DuCV是一种无囊膜，呈二十面体对称，病毒直径为15～16 nm，是鸭类已知最小的病毒。该病毒对外界环境抵抗能力较强，一旦感染很难清除。目前除了猪PCV和鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus,CIAV）可在体外培养外，其他圆环病毒均不能在体外培养，所以对DuCV的病原学特征研究十分有限。

DuCV基因组长约1.9 kb，与其他圆环病毒相似，具有3个主要开放阅读框，即ORF1、ORF2和ORF3。ORF1和ORF2位于病毒链的相反方向，分别编码一个参与病毒复制相关的33.6 kDa的Rep蛋白和一个具有免疫原性的29.7 kDa的核衣壳蛋白Cap蛋白[3,15]。根据衣壳蛋白及全基因组序列，DuCV-1又可分为DuC V-1a、DuCV-1b、DuCV-1c和DuCV-1d 4种亚型；
DuCV-2可分为DuCV-2a、DuCV-2b和DuCV-2c 3种亚型[16]。

在Cap蛋白基因和Rep蛋白基因之间有个茎环结构的序列被认为是病毒DNA复制的起始位点[16]。通过序列分析可知，DuCV基因组的Rep和Cap基因的基因间区域有一个四倍串联重复序列（quadruple Tandem Repeat,QTR），而在其他圆环病毒中没有。而且DuCV-1型和DuCV-2型毒株的QTR存在显著差异，且各自进化保守。进一步分析证实，DuCV-2的QTR为168 nt，由4个42 nt串联重复单元组成。DuCV-1的QTR长度为180 nt，包含4个45 nt长串联重复序列和8个长串联重复序列。除了Cap蛋白、Rep蛋白及茎环结构外，ORF3蛋白序列通常反向嵌套在ORF1的编码序列中，并被认为具有诱导细胞凋亡的功能活性[17]。

3.1 Rep蛋白

Rep蛋白位于圆环病毒的正义链上，由ORF1基因编码，长约292 aa。该蛋白的氨基酸同源性较高，通常被认为是圆环病毒复制所必须的蛋白。Rep蛋白作为滚环复制模式中复制起始酶家族中的一员，该蛋白包含3个保守氨基酸基序和dNTP结合的P环[18]。研究发现，Rep蛋白与茎环结构元件和4个重复的六聚体（H1、H2、H3、H4）共同组成圆环病毒起始复制的起点[19,20]。贾瑞琳[21]的研究发现，用荧光定量PCR与免疫组化的方法测定Rep蛋白第6位氨基酸突变的DuCV感染的樱桃谷鸭，结果显示，Rep蛋白第6位氨基酸突变可减少该病毒在免疫器官的增殖，但该蛋白第18位氨基酸突变则对病毒的增殖无明显影响。同时Rep蛋白N-糖基化位点突变对雏鸭的致病性无明显影响。除了Rep蛋白在复制过程中起重要作用外，研究发现，DuCV基因组的Rep和Cap的基因间区域有一个四倍串联重复序列QTR，荧光素酶报告基因分析表明QTR作为下游序列元件（downstream Sequence Element,DSE）的多聚腺苷酸信号能增强mRNA的稳定性，同时，DuCV的反向遗传研究发现，QTR缺失导致病毒基因的转录和复制显著缺陷[22]。

核定位信号（nuclear localization signal,NLS）是一种短的信号肽，可位于多肽序列的任何部分，一般含有4～8个氨基酸，且没有专一性，其可帮助亲核蛋白进入细胞核，对基因组的复制与转录具有促进作用。Wang等[23]研究结果表明，DcCV两种基因型Rep蛋白未含10～37位氨基酸残基可以取消核定位，而Rep蛋白含244～274位C端NLS则没有显著改变其亚细胞定位，证实了Rep蛋白N端10-37残基的NLS具有核靶向活性，这表明Rep蛋白可能在病毒复制过程中定位到细胞核中。

3.2 Cap蛋白

Cap蛋白由ORF2基因编码，位于圆环病毒的负义链上，为DuCV的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，对病毒入侵和感染具有重要的作用。相关研究表明，在PCV1、PCV2和BFDV的Cap蛋白的N端有很高比例的碱性氨基酸[24]，并且Cap蛋白N端具有2个或3个核定位信号[25-27]。Xiang等[28]使用在线PROSITE计算机程序预测发现DuCV Cap蛋白的第2个和第36个氨基酸残基之间存在两个潜在的NLS，并通过不同截断的Cap序列和EGFP-tagged在体外昆虫细胞中成功表达。结果表明，在感染Sf9细胞中表达Cap和EGFP标记的蛋白，在相同条件下，截断NLS区的Cap蛋白的表达水平高于未截断Cap蛋白表达量，说明DuCVCap蛋白N端NLS调控了该蛋白的表达水平，同时，DuCV Cap的第36个氨基酸残基有可能作为NLS、DNA结合信号（DNAbinding signals,DBSs）和表达水平调控信号，介导Cap蛋白与细胞核和病毒基因组的关联，Cap蛋白与DNA结合的能力加上这种蛋白质具有核定位信号，表明它可能负责对病毒基因组核的靶向性。

Cap蛋白作为衣壳蛋白，常被用于血清的制备、疫苗的研发及血清学检测方法的建立。张兴晓等[29]将鸭圆环病毒Cap基因克隆至杆状病毒载体，经筛选后转染至Sf9昆虫细胞表达的蛋白与小鼠制备的多抗具有良好的反应原性，为Cap蛋白功能研究奠定基础。许宗丽等[30]将新城疫的F基因与鸭圆环病毒的Cap基因均克隆至同一真核表达载体，构建融合表达质粒，并将其制备成为DNA疫苗，结果显示，免疫不同的剂量机体可产生不同效价的抗体，攻毒保护率也不一致。Huang等[31]以真核载体pcDNA3.1为基础，分别编码Cap基因全长重组质粒、缺失核定位信号编码序列的Cap基因重组质粒和无NLS但有组织型纤溶酶原激活物分泌信号肽的Cap基因重组质粒，通过测量Cap蛋白特异性抗体和相关细胞因子水平来评估这3种DNA疫苗的免疫原性，结果表明，不同亚细胞形态的Cap蛋白具有良好的免疫原性，无NLS但有组织型纤溶酶原激活物分泌信号肽的Cap基因重组质粒DNA疫苗表达的分泌性Cap蛋白可能是一种有前途的疫苗，可以提高对DuCV感染的保护性免疫应答。

3.3 ORF3蛋白

DuCVORF3蛋白是一种新发现的具有凋亡活性的病毒蛋白，序列比较分析结果表明DuCV在同一基因型内，ORF3的同源性达到95.8%～100%。由于ORF3碱基T/A在236核苷酸上的差异，DuCV-1 ORF3蛋白的翻译被过早的终止密码子所终止，因此，DuCV-1的ORF3蛋白C端比DuCV-2的ORF3蛋白C端短20 aa[32]。最新研究表明，与分散在细胞质中的DuCV-1相比，DuCV-2 ORF3蛋白的核定位增强了其凋亡活性，而对DuCV-1和DuCV-2中ORF3蛋白的凋亡活性分析表明，DuCV-2 ORF3能自我抑制病毒诱导的细胞凋亡活性。DuCV-2的ORF3蛋白C端20个残基包括1个变异的单组分型NLS，该NLS可调控蛋白的核定位。通过TUNEL检测和流式细胞仪分析，DuCV-1的ORF3蛋白诱导的细胞凋亡水平高于DuCV-2的ORF3蛋白诱导的细胞凋亡水平；
截断DuCV-2 ORF3蛋白C端20个残基后表达，ORF3的凋亡活性会显著增高，由此可推断DuCV-2 ORF3蛋白C端20个残基抑制了该蛋白的凋亡活性[33]。Xiang等[18]将ORF3重组杆状病毒感染Sf9细胞，通过流式细胞仪分析细胞凋亡情况，无论在感染后的任何时间段，重组杆状病毒诱导细胞凋亡水平均高于野生型杆状病毒诱导细胞凋亡的水平。以上研究成果也证明了DuCV ORF3蛋白有可能与DuCV的发病机制有关，而ORF3凋亡活性的差异可能反映了DuCV基因1型和基因2型的致病机制的差异。以上研究的猜想也符合了目前DuC V-1广泛的流行，而DuCV-2只是小范围流行的趋势。

鸭圆环病毒病是一种严重的免疫抑制性疾病，使得机体继发或多重感染。近年来，鸭圆环病毒与其他病原菌混合感染病例报道的趋势在不断增加，鸭圆环病毒病的预防和治疗迫在眉睫。虽然从鸭圆环病毒发现至今，研究人员对该病毒的病原学、基因组结构和功能、致病机理及疫苗的研制等进行了大量的研究工作，但是目前，对于预防DuCV感染还没有有效的措施，同时DuCV又缺乏细胞培养系统用来在体外增殖分离病毒，这对DuCV的疫苗的研制带来了挑战。过去的十几年里，研究人员虽然建立了多种检测方法，但只是用于临床样本的检测及监控该病毒的遗传进化趋势，相关有效的商品化疫苗还未应用于临床，因此，开发出安全、有效、特异的鸭圆环病毒疫苗是防控该病的关键，同时也为我国养鸭业提供一份保障。