硒化秦巴硒菇多糖对A549细胞增殖的抑制作用

孟敏，安红霞，俞永智，王霞，雷文娟，孙延庆，4

（1.甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州，730000；
2.甘肃中医药大学第一临床学院，甘肃 兰州，730000；
3.甘肃省人民医院骨外科，甘肃 兰州，730000；
4.甘肃省人民医院教学部，甘肃 兰州，730000）

肺癌是呼吸系统的恶性肿瘤，是全世界最致命的癌症之一。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤，据国家癌症中心最新统计，我国肺癌的发病率和病死率位居第一［1］。肺癌按照病理分型，可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中非小细胞肺癌占80%~85%，由于早期NSCLC无明显症状，大多数患者确诊时已经处于晚期或者有远处转移，5 a生存率低［2］。目前，化疗是治疗中晚期NSCLC的常用方法，包括顺铂、依托泊苷等化疗药物［3］，但化疗药物容易产生不同程度的胃肠道反应、白细胞减少等不良反应，严重的会造成肝肾损伤［4］。中医认为，肺癌属于“肺积”“肺痿”范畴，多与正气虚弱、外邪犯肺、饮食不节等有关，中医因其独有的辩证治疗体系，在肺癌治疗中具有一定的治疗优势和治疗特点［5］。目前，中药及其有效成分的抗肿瘤研究已有诸多报道，中药中的生物碱、萜类、黄酮类、植物多糖类等成分都有很好的抗肿瘤活性［6-8］。植物多糖具有降血糖、降胆固醇、抗病毒、提高免疫力以及抗肿瘤的药理活性，其中，香菇多糖作为抗肿瘤药物辅助剂已经应用于临床［9-10］。硒是人体健康不可或缺的微量元素，具抗氧化、排毒和免疫调节作用［11］。研究表明硒蛋白可用作分子分型和肿瘤预后的生物标志物，含硒化合物可以抑制肿瘤生长，并能够增强抗肿瘤药物的功效［12］。硒化秦巴硒菇多糖（Se-ABM）作为一个富含硒元素的多糖，其对人非小细胞肺癌A549细胞的治疗效果和作用机制尚不明确，本研究以潜在的抗肿瘤活性成分硒化多糖Se-ABM为研究对象，用CCK-8分析Se-ABM对A549细胞增殖抑制效果；
用流式细胞分析Se-ABM对A549细胞周期影响；
用蛋白免疫印迹分析Se-ABM作用于A549细胞后DNA损伤相关因子ATM、ATR、p53、γ-H2AX及细胞凋亡关键蛋白BAX、Bcl-2、BRCA1、Cas3和Cas9的表达，阐明其诱导A549细胞发生细胞损伤的作用机制，旨为临床治疗非小细胞肺癌提供辅助策略及新思路。

1.1 材料与仪器

拓扑替康（Topotecan）购自迈瑞尔化学技术有限公司（中国上海）。Se-ABM购自甘肃中医药大学实验中心（中国兰州）。人结肠癌细胞（HT 29）、人肝癌细胞（HepG2）、人宫颈癌细胞（HeLa）和非小细胞肺癌细胞（A549）细胞系购自中国科学院细胞库（中国上海）。试验中Se-ABM用纯净水制备为初始浓度为100 mmol/L原液。阳性对照药物拓扑替康用DMSO溶解制成浓度为100 mmol/L的原液。ATM antibody（CST公司，美国），ATR antibody（CSTG公司，美国），p53 antibody（abcam公司，美国），γ-H2AX antibody（abcam公司，美国），BAX an⁃tibody（CST公司，美国），BRCA 1 antibody（CST公司，美国），Bcl-2 antibody（abcam公司，美国），Cas⁃pase 3（Cas 3）antibody（abcam公司，美国），Caspase 9（Cas 9）antibody（abcam公司，美国），β-actin anti⁃body（Santa Cruz公司，美国）。倒置显微镜（Olym⁃pus公司，日本）；
高速冷冻离心机、电泳仪、转膜仪、酶标仪、PCR仪、Western blot曝光仪（Bio-Rad公司，美国）；
INC153型CO2培养箱（Memmert公司，德国）；
流式细胞仪（BD公司，美国）；
细胞超净工作台（ESCO公司，新加坡）。

1.2 方法

1.2.1 细胞活力的测定 人结肠癌细胞（HT 29）、人肝癌细胞（HepG2）、人宫颈癌细胞（HeLa）和人非小细胞肺癌细胞（A549）用含10%小牛血清RPMI 1640或DMEM培养基置于37℃、5%CO2条件下培养，在细胞进入对数生长期时进行传代培养。试验中用CCK-8试剂盒检测Se-ABM抑制A549细胞生长的抑制率。取对数生长期的细胞接种于96孔板中，于37℃、5%CO2条件下培养。细胞贴壁培养后，在培养基中加入不同浓度的Se-ABM和Topotecan，每个浓度设置6组复孔，对照组为只加入完全培养基培养的细胞。培养72 h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，将细胞板在培养箱中继续孵育4 h后，用全功能多波长酶标仪测定其在450 nm处的吸光度，试验重复3次。

1.2.2 流式细胞分析 将对数生长期的细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁生长后，加入不同浓度的Se-ABM和Topotecan进行处理，对照组加入等体积的含DMSO的培养液，继续培养24 h，收集细胞，用不含EDTA的胰酶消化，离心并收集细胞，弃去培养液，并加入1 mL碘化丙啶（PI）染色液，避光孵育染色15 min后，用流式细胞仪检测。

1.2.3 免疫印迹试验 取对数生长期A549细胞，传代贴壁生长后用不同浓度的Se-ABM和Topote⁃can处理，阴性对照为不加任何药物处理的细胞。24 h后，弃培养液，加入裂解液低温提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白提取液加入上样缓冲液变性，以相同的总蛋白量上样，加入5%浓缩胶、10%分离胶进行SDS-Page凝胶电泳分离，转膜，封闭，加入1∶1 000一抗，4℃过夜，TPS洗涤，加入稀释比例为1∶10 000的二抗，室温下孵育2 h，洗涤，加ECL显色液，凝胶成像系统（ChemDoc-It610，UVP，USA）曝光仪曝光，分析数据，试验重复3次。

1.3 统计学分析

使用SPSS 21.0软件（Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计学分析，t检验分析组间差异显著性，数据均表示为±s，P<0.05被认为具有统计学意义。

2.1 Se-ABM抑制肿瘤细胞增殖

如图1所示，筛选Se-ABM对肿瘤细胞增殖抑制作用，用0、50、100、200µg/mL的Se-ABM处理HT-29细胞、HepG2细胞、A549细胞以及HeLa细胞72 h，相同浓度的Topotecan作为阳性对照，CCK法测定细胞存活率。结果发现，不同浓度的Se-ABM对包括A549细胞、HT-29细胞、HepG2细胞和HeLa细胞在内的肿瘤细胞都有抑制增殖的效果，并随着Se-ABM浓度的增加抑制效果更加的显著，其中，50、100、200µg/mL Se-ABM抑制HT 29细胞增殖作用和0µg/mL比较均有显著差异（P<0.05）；
同 样 地，在HepG2细 胞 中，50、100、200µg/mL Se-ABM抑制HepG2细胞增殖作用和0µg/mL比较，均有显著差异（P<0.05）；
在A549细胞中，50、100、200µg/mL Se-ABM抑制细胞增殖时更为显著，在200µg/mL时，和0µg/mL比较，具极显著差异性（P<0.01）；
而在HeLa细胞中，Se-ABM 50µg/mL的浓度处理细胞后，和0µg/mL比较，差异不显著（P>0.05），100、200µg/mL时，跟0µg/mL比较，差异显著（P<0.05）。

图1 Se⁃ABM对不同细胞的抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of Se⁃ABM on different cells

2.2 Se-ABM阻滞A549细胞周期在G2/M期

用不同浓度的Se-ABM处理A549细胞24 h，收集细胞，用PI染色并用细胞流失仪分析细胞周期分布情况。结果发现，50、100、200μg/mL Se-ABM使A549细胞G2/M期细胞增多，并呈浓度依赖性。如图2所示，Se-ABM的浓度为50μg/mL时，阻滞在G2/M期的细胞数为8.9%；
Se-ABM的浓度为100μg/mL时，阻滞在G2/M期的细胞数为10.2%，Se-ABM的浓度为200μg/mL时，阻滞在G2/M期的细胞数为19.3%。提示Se-ABM可能通过调控细胞周期，阻滞A549细胞周期在G2/M期，最终抑制A549细胞增殖。

图2 不同浓度Se⁃ABM对A549细胞周期的影响Figure 2 Effects of different concentrations of Se⁃ABM on A549 cell cycle

2.3 Se-ABM诱导A549细胞DNA损伤

用50，100，200µg/mL的Se-ABM处理A 549细胞24 h后，免疫印迹试验结果显示，DNA损伤相关因子ATM、ATR、p53和γ-H2AX的表达量明显升高（图3）。随着Se-ABM浓度的增加，损伤因子的变化呈浓度依赖性，和阴性对照组比较，Se-ABM在50µg/mL时就能够诱导A549细胞损伤因子ATM、ATR、p53和γ-H2AX表达增多，和阳性对照组拓扑替康比较，在50µg/mL时，诱导A549细胞损伤的效果显著，由此可以看出，Se-ABM能够诱导A549细胞发生DNA损伤，进而引起组蛋白发生应激变化，最终导致A549细胞的增殖被抑制。

图3 不同浓度的Se-ABM对A549细胞DNA损伤相关因子表达的影响Figure 3 Effects of different concentrations of Se-ABM on the expression of DNA damage-related factors in A 549 cells

2.4 Se-ABM诱导A549细胞凋亡

肿瘤细胞在受到辐射或者抗肿瘤药物作用后会诱导细胞发生损伤，细胞中存在的损伤修复机制不能修复损伤后，细胞会发生凋亡，BAX是主要的细胞凋亡因子，Bcl-2是主要的抗细胞凋亡因子，而BRCA1、Cas3以及Cas9是下游主要的凋亡因子，其中BAX和Bcl-2的相对改变是细胞凋亡的显著特征。用50，100，200µg/mL的Se-ABM处理A549细胞24 h后，免疫印迹试验结果显示，与对照组（Control）相比，试验组细胞凋亡蛋白因子BAX，BRCA1，Cas3和Cas 9的表达量明显上升，而Bcl-2蛋白的表达随给药浓度的增加而减少（图4）。由此可以看出，在A549细胞中，Se-ABM能诱导A549细胞发生细胞损伤最终导致细胞凋亡。

图4 不同浓度的Se-ABM对A549细胞凋亡相关蛋白的影响Figure 4 Effects of different concentrations of Se-ABM on apoptosis-related proteins of A 549 cells

近几年，非小细胞肺癌患病率逐年攀升，但化疗缓解率较低且毒副反应严重，尤其影响肝功能、造血功能和机体免疫力［13］。此外，化疗药物的长期使用极易发生耐药性，比如鬼臼毒素衍生物拓扑替康［16］，这就需要开发新的治疗方法以获得更有效地治疗效果。中医药以辩证施治为原则，对疾病的治疗强调“阴阳调和”，通过提高机体自身的免疫力，增加肿瘤治疗的效果［14-15］。天然产物药用资源由于含有活性次生代谢产物，已在抗肿瘤治疗中获得应用［17-18］。现代药理研究表明，秦巴硒菇多糖（Se-ABM）不仅有抗氧化、免疫调节、降血糖、降血压、降胆固醇等作用，同时也具有抗肿瘤活性［19］。课题组前期研究发现，秦巴硒菇多糖提取物能抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡［20］。但Se-ABM对其他肿瘤的抑制作用及机制还未见报道，故本文初步研究了Se-ABM对HT 29、HepG2、HeLa和A549细胞的抗肿瘤活性，发现Se-ABM对以上细胞均有抑制作用并呈浓度依赖性，其中，对非小细胞肺癌细胞增殖抑制更明显，故选择A549细胞展开了更进一步的研究。

DNA损伤后，细胞在损伤累计的情况下会发生细胞周期阻滞以促进DNA的修复，或发生凋亡等途径清除未能修复的细胞［21］，在肿瘤细胞中，H2AX蛋白属于组蛋白家族成员，其主要在肿瘤细胞DNA双链损伤应答中起作用，H2AX的磷酸化（γH2AX）在大量细胞核损伤事件中均有参与［22-24］，相关文献报道A549细胞受到辐射或者其他因素的影响后，细胞内DNA双链结构发生断裂且断裂位置附近的H2AX会发生磷酸化修饰，引起无法逆转的细胞损伤，导致细胞周期阻滞，最终诱导细胞凋亡［25］。另外p53作为抑癌基因之一，在正常状态下呈低水平表达，当细胞在各种应激包括DNA损伤时，p53可以被上游蛋白如ATM和ATR等激活，其中ATM和ATR属于三磷酸肌醇激酶家族的成员，分别感应不同形式的DNA损伤，激活的p53进一步增强其下游多种基因的转录引起细胞周期阻滞及凋亡等［26-29］。Se-ABM能够调控A549细胞周期，使细胞周期阻滞在G2/M期，并且免疫印迹结果显示DNA损伤相关因子γH2AX、P53、ATM及ATR的表达随着Se-ABM浓度的增加逐渐升高。在细胞凋亡中BAX是主要的促凋亡因子，Bcl-2是主要的抗凋亡因子，两者活性的改变调控下游主要凋亡因子BRCA1、Cas3以及Cas9的表达。因此，BAX和Bcl-2的相对改变是肿瘤细胞发生凋亡的显著特征。研究发现Se-ABM作用于A549细胞后，试验组的BAX、BRCA1、Cas3和Cas9的表达和对照组比较明显增加，同时，Bcl-2在实验组中的表达明显下降。

Se-ABM能够使A549细胞的DNA双链发生断裂，使H2AX磷酸化增加，γ-H2AX快速传导DNA损伤信号，同时激活了包括p53在内的关键信号分子，导致相关信号通路被激活，进一步引发一系列生物级联反应和细胞学反应，调控细胞周期，使肿瘤细胞发生凋亡并趋于死亡。而Se-ABM通过DNA损伤调控A 549细胞周期阻滞在G2/M期的具体机制还需要进一步的研究和探讨。综上，本论文研究结果为Se-ABM作为潜在抗肿瘤辅助因子提供了参考和依据。

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