甘肃省天水市2020年猪链球菌II型的流行毒力基因分析

樊天喜，李健，吴锦艳，杨梅，付宏雅，李国圆，李红梅，张明亮，李万宏

（1.张家川县动物疫病预防控制中心，甘肃 天水 741500；
2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730030；
3.张家川县张棉驿乡农业综合服务中心，甘肃 天水 741505）

猪链球菌病（Swine streptococcal diseases）是一种由猪链球菌（Streptococcus）引起的一种人畜共患传染病，我国将其划定为II类动物疫病［1］。链球菌属的细菌种类繁多，在自然界中分布广泛，可引起人、猪、牛、马、羊和禽等多种动物感染。猪链球菌病是一种接触性、热性传染病，可引起猪脑膜炎、关节炎、败血症，会导致母猪流产以及仔猪的突然死亡［2］。

猪链球菌呈圆形或卵圆型，常呈链状排列，长短不一，是一种具有荚膜的革兰阳性兼性厌氧菌，血清型复杂［3］。根据荚膜多糖抗原种类的多样性，可以至少被划分为35种不同的血清型［9］。但是，并非所有的血清型都具有致病性，大多数致病性血清型在1至9血清型。研究表明1，2，7和9是猪的致病菌［1］。国内不同地区猪链球菌血清型存在较大差异，河北、四川、广东等省分离株多为2，7，9型［5-7］，东北地区多为1，2，7，9型［8］。西北地区中新疆分离株多为1，2型，甘肃、青海和宁夏等地区为2，7型［9-10］。猪链球菌具有多种血清型，在其他国家流行的菌株与中国存在较大的差异。在法国、意大利和西班牙等国家，感染猪链球菌的病猪中，血清型为II型的占70%；
血清型9型的猪链球菌在比利时、荷兰等国家被报道；
在英国常见的血清型为1型、2型、14型。

猪链球菌的致病性和毒力因子相关，不同地区分离株毒力相差较大，主要与毒力因子的不同组合有关。基于毒力致病因子的不同，可以将猪链球菌划分为强毒株、弱毒株及无毒株。猪链球菌的毒力因子主要包括荚膜多糖（CPS）、胞外因子（EPF）、溶菌酶释放蛋白（MRP）、溶血素（SLY）。其中，CPS可以保护细菌，抵抗吞噬。CPS的结构成分与细菌的致病性和血清型有关，并且不同地区分离菌株的毒力基因存在较大的差异［11］。其中mrp、epf和sly被证明是强毒株的标志［12］。同时，EPF和MRP的存在提高了菌株的致病力。

为了调查甘肃省天水市张家川县的猪链球菌Ⅱ型及毒力基因流行情况，本研究对甘肃省天水市张家川县10个规模化猪场疑似猪链球菌病例共采集血清样本267份，进行猪链球菌及猪链球菌II型的流行状况检测。同时，本研究设计并采用3对引物分别特异性扩增溶菌酶释放蛋白（MRP）、胞外因子（EPF）和溶血素（SLY）基因，进行毒力因子的检测，以期为本地区猪链球菌疫情预警和防控措施提供一定的参考。

1.1 材料

1.1.1 临床样本 无菌采自甘肃省天水市张家川县的10个规模化猪场猪血液样本267份；
无菌采集猪链球菌II型血清学检测阳性猪的脑、肺脏和关节液等样本18份。

1.1.2 试验材料 胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）为OXOID公司产品，新生犊牛血清为四季青生物制品有限公司产品，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）为南京生兴生物技术有限公司产品；
细菌DNA提取试剂盒为大连宝生物科技有限公司产品；
菌株血清1、2、7和9型的猪链球菌（SS）由广东省农业科学院动物卫生研究所猪病研究室提供2×Taqmaster Mix、DL2000DNA Marker，购 自Ta⁃KaRa公司、基因组DNA提取试剂盒，购自天根生物有限公司；
猪链球菌II型ELISA抗体检测试剂盒，购自武汉科前生物股份有限公司；
引物合成由生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 临床样本的采集 无菌采集不同年龄段猪前腔静脉血，37℃静置1 h后，4℃静置2 h，4 000 r/min离心10 min，收集血清样本，存放于-80℃备用。同时将猪的脑、肺脏和关节液等样本18份病料进行研磨等处理后，放置4℃静置过夜，后取上清液，存放于-80℃备用。

1.2.2 细菌培养与基因组DNA提取 用TSB培养基（含10%犊牛血清，30 mg/L NAD）37℃220 r/min分别培养1.2.1的菌株12 h，12 000 r/min离心5 min获得细菌团块。按照1.2.2中的细菌DNA提取试剂盒说明书，抽提细菌的DNA，经紫外线分光光度计测定浓度后，保存在-20℃备用。

1.2.3 引物合成 猪链球菌引物合成以猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因（gdh）为模板，用Primer 5.0软件设计特异性引物，经上海生物工程有限公司合成引物，用ddH2O将引物稀释至10 pmol/μL，保存在-20℃备用。参照先前报道［9］合成猪链球菌的3种主要毒力基因epf、mrp、sly的特异性引物，引物序列的具体信息如表1。

表1 扩增猪链球菌毒力因子的引物序列Table 1 Primer sequence of amplication of streptococcus suis virulence factor

1.2.4 猪链球菌血清学检测 使用猪链球菌ELISA抗体检测试剂盒和猪链球菌II型ELISA抗体检测试剂盒对临床样品样品进行ELISA检测，2种ELISA抗体检测试剂盒的结果判定：猪链球菌ELISA结果判定：根据标准曲线，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度；
检测范围0.5~15 ng/L；
猪链球菌II型ELISA抗体检测结果判定：在酶标仪上测各孔D630nm值，试验成立的条件是：阳性对照孔D630nm值均应≥0.8，且<2.0；
阴性对照孔D630nm值均应<0.3。如果样品D630nm值≥0.35，判为阳性，如果样品D630nm值<0.35，判为阴性。详细的操作步骤，参照说明书。

1.2.5 毒力因子PCR鉴定 将上述1.2.2中研磨的组织，取提取细菌的全基因组DNA，通过倍比稀释后进行平板计数，根据菌液浓度将细菌调整至1×109cfu/mL，然后10倍浓度梯度稀释至1×10 cfu/mL，18份组织进行猪II型链球菌epf、mrp、sly3种毒力基因的PCR扩增。反应条件为95℃5 min；
94℃30 s；
退火温度（sly：63℃、mrp：59℃、epf：60℃）30 s、72℃1 min，35个循环；
72℃10 min；
4℃5 min。PCR产物经琼脂糖核酸电泳检测，PCR阳性产物送生工生物工程股份有限公司测序。

2.1 猪链球菌血清学检测结果

如表2阳性率（%）显示：267份被检血清中猪链球菌抗体阳性率达26.2%（70/267），10个猪场阳性率高达60%（6/10），猪链球菌感染在天水市张家川县猪场普遍存在，但各猪场感染率情况有一定差异，其中马关镇宏升养殖场和龙山镇榆树村养猪场的猪链球菌感染率较高，其余各村养殖场感染率较低。

表2 267份血清样品猪链球菌抗体检测结果Table.2 The antibody detection results of Streptococcussuis in 276 serum samples

2.2 猪2型链球菌血清学检测结果

本研究中对结果2.1中猪链球菌血清抗体检测为阳性的样品，进一步进行猪链球菌II型特异性血清学检测，具体检测结果如表3。70份猪链球菌阳性血清抗体中猪II型链球菌抗体阳性率为38.5%（27/70），267份被检血清中猪II型链球菌抗体阳性率10.1%（27/267），10个猪场阳性率达40%（4/10），表明猪II型链球菌在天水市张家川县各个村镇分布范围较广，感染率较高，其中马关镇宏升养殖场、龙山镇榆树村和大阳镇小阳村养猪场的猪链球菌II型感染率较高，其余各村养殖场感染率较低。

表3 猪II型链球菌抗体检测结果Tab.3 The antibody detection results of Streptococcussuis typeⅡ

2.3 毒力基因的鉴定及分布

用上述合成的3对猪链球菌引物对从猪的脑、肺脏和关节液（图1）等18份样本分离培养得到的18株链球菌，进行mrp、epf和sly3种毒力基因进行特异性扩增。PCR分别扩增出626 bp（图2-A）、885 bp（图2-B）和1 502 bp（图2-C）片段，与预期结果相符。然后，将上述检测阳性的PCR产物进行测序。测序分析结果表明mrp、epf和sly3种毒力基因与Genebank中序列同源性在95%~100%。18株II型猪链球菌的mrp、sly和epf中共有7种基因型，基因型为epf+mrp+sly+有5株，占27.7%；
基因型为epf+mrp―sly+的有3株，占16.7%；
epf+mrp―sly―的有3株，占16.7%；
epf-mrp―sly+的有1株，占5.56%；
epf―mrp+sly―的有3株，占16.7%；
epf+mrp+sly―的有1株，占5.56%；
epf+mrp―sly+的有2株占11.1%。上述结果表明甘肃省天水市张家川县流行的猪链球菌II型以毒力相对较高的epf+mrp+sly+为主，其次是epf+mrp―sly+型、epf+mrp―sly―型和epf-mrp+sly―。

图1 猪链球菌II型典型的关节炎临床症状Figure 1 The representative clinical symptoms of arthritis of Streptococcussuis type II

图2 PCR鉴定猪链球菌II型毒力因子结果Figure 2 PCR results of virulence factors of Streptococcussuis type II

猪链球菌在我国各地都有发生，其传播机制主要通过直接接触或污染环境进行水平传播［13］。猪链球菌血清型II型是毒力最强、流行范围最广，最容易引起人和动物感染的血清型［14-15］。该病不仅影响畜牧养猪业的健康发展，也对相关从业者的健康以及公共安全造成危害隐患［3，16-17］，继发脑膜炎、心内膜炎、中毒性休克，甚至死亡，死亡率可达17.8%［13］。猪链球菌可感染黄牛、奶牛、羊、猪、马、驴犬、猫及啮齿类动物。根据报道甘肃刘家峡养殖杂交鲟暴发疑似海豚链球菌病的病原情况，随机扩增多态性DNA显示海豚链球菌为血清Ⅱ型［18］；
犬感染本菌后表现为突然死亡；
猫通常表现为肺炎和湿性皮炎；
马感染该菌后主要表现为脑膜炎、咽喉炎、化脓性肺炎和骨髓炎；
牛感染后主要表现为脑膜炎、关节炎和腹膜炎等，给全球公共卫生安全带来巨大隐患［19-20］。在我国至今已有多个省份报道猪链球菌的大面积流行，给我国的养殖业造成巨大损失。本次研究从甘肃省天水市张家川县部分地区10个未免疫接种猪链球菌疫苗的标准化猪场采集267份血清以及18份猪的脑、肺脏和关节液病料。利用特异性猪链球菌和猪链球菌II型ELISA检测试剂盒进行血清学检测。267份血清样品中链球菌抗体阳性率为26.2%，猪场阳性率达到60%。在感染猪链球菌的血清中检测出猪II型链球菌抗体阳性率为38.5%，猪场阳性率为40%，表明在甘肃地区张家川县猪II型链球菌血清型较为严重，其流行情况相较于甘肃省酒泉市地区稍好［13］。

猪链球菌的致病性和毒力因子相关报道，不同地区分离株毒力相差较大。mrp、epf和sly被证明是强毒株的标志［12］。本研究进一步对分离到的猪链球菌II型进行mrp、sly、epf毒力基因的检测，结果显示该18株猪链球菌II型的mrp、sly和epf中共有7种基因型，基因型为epf+mrp+sly+有5株（27.7%）、基因型为epf+mrp―sly+的有3株（16.7%）、epf+mrp-sly-的有3株（16.7%）占；
epf-mrp―sly+的有1株（5.56%）、epf-mrp+sly―的有3株（16.7%）、epf+mrp+sly-的有1株（5.56%）和epf+mrp―sly+的有2株（11.1%）。甘肃省天水市张家川县流行的猪链球菌II型以毒力相对较高的epf+mrp+sly+为主，其次是epf+mrp―sly+型、epf+mrp―sly―型和epf-mrp+sly―，这与其他报道的猪链球菌血清型及毒力基因基本一致［21-26］。

在猪病诊疗过程中，准确诊断和临床对症用药是及时治疗的关键。猪链球菌II型的基本治疗原则，首先通过药敏试验，筛选敏感抗菌药及不合理配伍。通过药敏试验研究对替加环素（100%）、美罗培南（98.98%）、头孢噻肟（97.96%）、氨苄西林（96.94%）等对猪链球菌和猪链球菌II型高度敏感［28］。同时结合临床症状进行对症治疗，例如淋巴结脓肿型，待脓肿成熟后，及时切开排除脓汁，用3%双氧水或0.1%高锰酸钾液冲洗后涂以碘酊；
出现发热及跛行应用氟尼辛葡甲胺等镇痛退烧进行肌肉注射；
对败血症型及脑膜脑炎型，应使用抗生素或磺胺类药物，卡那霉素和氨苄西林钠等联合应用，在兽医临床中都有良好治疗效果。

专业化养猪场应遵从“预防为主，治疗为辅”的基本原则。切实做好隔离“传染源”患病猪的措施；
加强日常猪舍的消毒，切断所有可能的“传播途径”；
将健康的猪群单独饲养在卫生环境良好的猪舍内，保护所有的“易感宿主”均不能够被患病猪或其它传染源感染。潜伏感染猪群定期做好猪链球菌菌苗的预防接种，由于猪链球菌存在35种血清型，不同菌苗对不同血清型猪链球菌感染无交叉保护力或交叉保护力较小，预防用疫苗最好选择相同血清型菌苗。猪链球菌病虽能够通过接种疫苗来预防，但由于存在较多的血清型，另外还有相当一部分并不能进行血清分型，以及各血清型之间的交叉保护较差，使得商业化疫苗并不能对所有的菌株起作用，但是临床上用于预防和治疗的不二选择仍然是抗生素。

猪链球菌株可以通过接触污染的生肉产品或者患病动物而导致人类感染，造成细菌性脑炎或引起中毒性休克综合征，应引起兽医界以及医学界的高度重视，加强猪链球菌株感染病猪及其相关制品的检疫刻不容缓。感染人主要通过接触病死猪，生猪饲养人员和屠宰加工人员是本病易感人群。在生猪养殖过程中饲养人员要注意个人安全防护，有外伤时应尽量避免接触病猪，发现病猪要及时通知兽医及时诊疗。屠宰加工人员在屠宰生猪时防止个人受伤，一旦受伤应立即处理伤口，经清洗消毒后使用抗菌素预防治疗。