乙酸钠对油酸诱导的BRL-3A细胞脂肪变性的影响及机制分析

李 林，宫彬彬，王广力，赵 梅，张源淑

(1.邢台学院生物科学与工程学院，邢台 054001；
2.河北医科大学附属邢台人民医院病理科，邢台 054031；
3. 南京农业大学动物医学院农业部动物生理生化重点开放实验室，南京 210095)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种以三酰甘油(triglyceride，TG)在肝蓄积为特征的疾病，近年来，由于脂肪和高糖等摄入增加、激素食品泛滥等因素，使NAFLD发病率逐年增高。NAFLD在鸡、狗、猪、牛、羊以及鱼等动物也可发生，是各种动物的原发或者继发性疾病，在鸡、鸭的发病率较高，该病不仅影响着养殖业的发展，也会带来一定的食品安全问题，给禽类养殖业造成严重的经济损失[1]。近年来，NAFLD越来越受到关注，因其发病机制复杂、诊断困难，已成为世界上最常见的慢性肝病。NAFLD通常与高血压、血脂异常、肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征、2型糖尿病和心血管疾病密切相关[2]。目前，NAFLD没有有效的治疗方案，主要以改变动物的饮食方式为主。

乙酸是一种短链脂肪酸(SCFA)，它是由摄入的膳食纤维刺激，经动物盲肠和结肠发酵产生[3-4]。据报道，膳食纤维可以降低餐后血糖反应、血浆胆固醇和三酰甘油浓度以及脂肪储存[5]。并且，Hara等[6]研究发现含有SCFA的无纤维饮食也能降低血清胆固醇。乙酸除了由结肠细菌发酵产生外，许多食物中均含有乙酸的成分。

肝是动物调节脂质代谢和维持脂质稳态的重要器官，通过肝切片发现，肝含有多种细胞类型，如肝细胞、库普弗细胞、内皮细胞和成纤维细胞[7]。研究表明，乙酸可以使小鼠肝TG含量降低，脂质氧化基因表达增加[8]。此外，乙酸可激活糖尿病KK-A(y)小鼠肝腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)蛋白，而AMPK作为能量的“传感器”和“调节器”，对肝的脂质代谢的调节具有重要作用[9]。目前，乙酸在调控肝代谢方面的研究较少，且不深入。因此，本试验通过油酸诱导BRL-3A细胞建立脂肪变性模型，分析乙酸钠是否对BRL-3A细胞脂肪变性模型具有调控作用，为乙酸钠对动物摄食调控及改善肥胖、健康方面的研究提供理论依据。

1.1 细胞来源

大鼠肝成纤维细胞(BRL-3A)购自中国科学院昆明细胞库，本实验室冻存。

1.2 主要试剂

乙酸钠、油酸购自美国Sigma公司；
TG试剂盒、油红O染色试剂盒、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司；
P-AMPK-兔/AMPK-兔抗体均购自艾博抗上海贸易有限公司；
山羊抗兔IgG购自上海生物工程有限公司；
BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；
DMEM培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素购自南京泽优生物科技有限公司。

1.3 BRL-3A细胞脂肪变性模型建立

1.3.1 BRL-3A细胞的培养与处理 BRL-3A细胞在DMEM高糖培养基中进行培养，内含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素/链霉素，置于含5% CO2的恒温培养箱(37 ℃)中培养，根据细胞生长状态，及时更换新鲜培养基，每隔2～3 d将细胞重新传代1次。当细胞融合度达到80%～90%时，贴壁细胞用含0.25%胰酶和0.02% EDTA胰酶消化液进行消化处理，将细胞接种于6孔板和96孔板中，加入新鲜培养基，置于恒温培养箱中培养。

1.3.2 不同浓度油酸处理BRL-3A细胞相对活力检测 接种于96孔板内的BRL-3A细胞融合度达到70%～80%时，弃去培养液。PBS洗涤后，分别加入含有不同浓度油酸(0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 mmol·L-1)的无血清培养基；
在5% CO2的恒温培养箱(37 ℃)中培养24 h。随后每孔细胞加入含0.5 mg·mL-1MTT的无胎牛血清培养液20 μL，继续培养4 h 后，弃上清液，再加入150 μL DMSO 充分溶解，用酶标仪检测各孔的吸光值，检测其细胞相对活力。

1.3.3 不同浓度油酸处理BRL-3A细胞总脂滴面积、TG、AST和ALT指标检测 将细胞按照合适密度接种于6孔板中，待细胞融合至80%时，弃去培养液，对细胞进行饥饿处理后，加入含有不同浓度油酸(0.03、0.06、0.12、0.24 mmol·L-1)的无血清培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后，PBS冲洗3遍，10%福尔马林将细胞固定30 min，室温条件下，PBS冲洗3遍，用油红O染液染色10 min，PBS缓冲液洗2次；
倒置显微镜观察细胞内脂滴染色情况，并进行统计分析。另外，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后收集细胞，弃上清进行TG含量、AST和ALT活性检测。

1.4 不同浓度乙酸钠处理BRL-3A细胞凋亡率指标检测

将细胞培养于6孔板中，当细胞融合度达到80%～90%时，用低(2 mmol·L-1)、中(4 mmol·L-1)、高(8 mmol·L-1)浓度的乙酸钠处理细胞24 h。收集细胞后加入200 μL的Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)原液重悬细胞，4 ℃避光孵育30 min，再加入10 μL碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min，采用美国BD FACS Calibur型流式细胞术检测荧光强度，计算细胞凋亡率。

1.5 乙酸钠对油酸诱导的BRL-3A细胞脂肪变性模型的影响

1.5.1 不同浓度乙酸钠处理脂肪变性细胞模型胞内脂滴变化检测 将细胞按照合适密度接种于6孔板中，待细胞融合至80%时，弃去培养液，对细胞进行饥饿处理后，将细胞分为油酸处理组(加入含有终浓度为0.12 mmol·L-1油酸的无血清培养基)，2 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组，4 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组和8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组。在2 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组、4 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组和8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组中，均为2 h后加入乙酸钠。在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后, PBS冲洗3遍，10%福尔马林将细胞固定30 min，室温条件下，PBS冲洗3遍，用油红O染液染色10 min，PBS缓冲液洗2次；
倒置显微镜观察细胞内脂滴染色情况，并进行统计分析。

1.5.2 不同浓度乙酸钠处理脂肪变性细胞模型TG、AST和ALT指标检测 接种于6孔板的细胞经过上述同样处理后，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后，收集细胞，弃上清，进行TG含量、AST和ALT活性检测，操作步骤按照说明书进行。提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定并计算出蛋白浓度。

1.5.3 不同浓度乙酸钠处理脂肪变性细胞模型AMPK通路蛋白检测 Western blot检测各处理细胞中P-AMPK/AMPK蛋白的表达变化，参照李林等[10]的方法进行操作。用ECL发光液进行Western blot图像处理。用Image Lab 6.0分析条带灰度值。

1.5.4 不同浓度乙酸钠处理脂肪变性细胞模型脂代谢相关关键基因检测 将收集的细胞采用TRIzol法直接提取总RNA，利用BioPhotometer测定样品总RNA浓度，分析OD260 nm/OD280 nm值，判断提取总RNA的纯度，OD260 nm/OD280 nm需要为1.8～2.0。取1 μg总RNA进行反转录得到cDNA,详细操作步骤参照说明书进行。

参照GenBank序列，用Primer Premier 5软件自行设计，设计完成后送上海Sangon公司合成，引物序列见表1。

表1 目的基因及β-Actin引物序列

1.6 数据统计与分析

2.1 不同浓度油酸对BRL-3A细胞相对活力的影响

图1所示，向细胞中添加不同浓度(0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 mmol·L-1)的油酸后，发现与对照组(0 mmol·L-1油酸)相比，0.48 mmol·L-1油酸对细胞有明显的抑制作用，且差异显著(P<0.05)。其他浓度的油酸处理细胞后与对照组相比，均无差异。结果提示：0.03～0.24 mmol·L-1的油酸对BRL-3A细胞无毒副作用。

2.2 不同浓度油酸对BRL-3A细胞总脂滴的影响

图2所示，与对照组相比，0.12和0.24 mmol·L-1油酸处理后细胞总脂滴面积均极显著上升(P<0.01)。

2.3 不同浓度油酸对BRL-3A细胞三酰甘油(TG)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)的影响

表2所示，向细胞中添加不同浓度(0.03、0.06、0.12、0.24 mmol·L-1)的油酸。发现与对照组相比，0.06 mmol·L-1油酸处理后，TG含量显著上升(P<0.05)；
并且在0.12和0.24 mmol·L-1油酸处理后，TG含量极显著上升(P<0.01)，提示造成了BRL-3A细胞的脂质蓄积。与对照组相比，0.12和0.24 mmol·L-1油酸处理后，BRL-3A细胞AST和ALT活性显著上升(P<0.05)；
其他浓度的油酸处理细胞后，AST和ALT活性均无显著差异。

综合以上细胞活力、细胞总脂滴面积、TG含量和AST、ALT活性测定结果，本试验用不同浓度油酸诱导建立BRL-3A细胞体外脂肪变性模型的条件: 0.12 mmol·L-1油酸，培养时间为24 h。因此，后续选取0.12 mmol·L-1油酸进行诱导脂肪变性细胞模型处理试验。

与对照组(0 mmol·L-1)相比，*. P<0.05Compared with control group(0 mmol·L-1)，*. P<0.05图1 油酸对BRL-3A细胞相对活力分析Fig.1 Analysis of the relative activity of oleic acid on BRL-3A cells

与对照组相比，**表示差异极显著(P<0.01)Compared with control group，**.P<0.01图2 油酸处理BRL-3A细胞总脂滴面积结果分析Fig.2 Analysis of total lipid droplet area of BRL-3A cells treated with oleic acid

表2 油酸对BRL-3A细胞三酰甘油(TG)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)的影响分析

2.4 不同浓度乙酸钠对脂肪变性细胞模型总凋亡率的影响

分别用低(2 mmol·L-1)、中(4 mmol·L-1)、高(8 mmol·L-1)浓度的乙酸钠作用BRL-3A细胞24 h后，通过流式细胞术检测细胞凋亡率，发现不同浓度的乙酸钠对细胞凋亡率均无影响(图3)，证明乙酸钠对细胞无毒害作用，可以进行下一步试验。

图3 乙酸钠对BRL-3A细胞总凋亡率分析Fig.3 Analysis of sodium acetate on total apoptosis rate of BRL-3A cells

2.5 不同浓度乙酸钠对脂肪变性细胞模型脂滴的影响

图4所示，用0.12 mmol·L-1油酸分别和2、4、8 mmol·L-1的乙酸钠共同孵育细胞24 h后，与油酸处理组相比，4 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组和8 mmol·L-1+油酸处理组细胞总脂滴面积和每平方毫米脂滴数极显著下降(P<0.01)。提示，4和8 mmol·L-1的乙酸钠可以显著降低脂肪变性细胞模型的脂质堆积。

与油酸处理组相比，**. P<0.01Compared with oleic acid treatment group，**.P<0.01图4 乙酸钠对脂肪变性细胞模型脂滴影响分析Fig.4 Analysis of sodium acetate on lipid droplets in steatosis cell models

2.6 不同浓度乙酸钠对脂肪变性细胞模型三酰甘油(TG)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)的影响

表3所示，向细胞中添加不同浓度的乙酸钠后，发现与油酸处理组相比，4 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理后，TG含量、AST活性和ALT活性均显著下降(P<0.05)；
并且在8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理后，与对照组相比，TG含量极显著下降(P<0.01)，ALT、AST活性均显著下降(P<0.05)。

表3 乙酸钠对脂肪变性细胞模型三酰甘油(TG)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)的影响分析

2.7 不同浓度乙酸钠对脂肪变性细胞模型AMPK信号蛋白的影响

进一步检测细胞AMPK相关信号通路，结果发现(图5)，与油酸处理组相比，4 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组P-AMPK表达水平显著上调(P<0.05)；
8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组P-AMPK表达水平极显著上调(P<0.01)。提示，乙酸钠激活了脂肪变性细胞模型的AMPK信号通路。

与油酸处理组相比，*.P<0.05, **.P<0.01Compared with oleic acid treatment group, *.P<0.05, **.P<0.01图5 脂肪变性细胞模型P-AMPK蛋白表达水平变化Fig.5 The P-AMPK protein expression level in steatosis cell models

2.8 不同浓度乙酸钠对脂肪变性细胞模型脂合成代谢关键基因的影响

通过检测与AMPK信号通路下游相关的关键脂合成代谢基因，图6A发现,与油酸处理组相比，4 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组和8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组ACC mRNA表达含量均显著下降(P<0.05)；
图6B发现,与油酸处理组相比，8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组FAS mRNA表达含量显著下降(P<0.05)，而其他乙酸钠+油酸处理组与油酸处理组相比，均无显著差异；
图6C发现与油酸处理组相比，2、4、8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组SCD-1 mRNA表达含量均显著下降(P<0.05)。

与油酸处理组相比，*.P<0.05Compared with oleic acid treatment group，*.P<0.05图6 脂肪变性细胞模型脂合成代谢基因表达Fig.6 The expression levels of lipid anabolism genes in steatosis cell models

2.9 不同浓度乙酸钠对脂肪变性细胞模型脂分解代谢关键基因的影响

通过检测与AMPK信号通路下游相关的关键脂分解代谢基因，图7A发现与油酸处理组相比，4 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组和8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组CPT-1 mRNA表达量均显著上升(P<0.05)；
图7B发现，与油酸处理组相比，8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组CPT-2 mRNA表达量显著上升(P<0.05)；
而图7C发现，2、4、8 mmol·L-1乙酸钠+油酸处理组ACO mRNA表达量，与油酸处理组相比，均无显著差异。

与油酸处理组相比，*.P<0.05Compared with oleic acid treatment group，*.P<0.05图7 脂肪变性细胞模型脂分解代谢基因表达Fig.7 The expression levels of lipid catabolism genes in steatosis cell models

3.1 油酸诱导脂肪变性细胞模型的建立

脂肪肝的发生与动物肝脂质代谢的异常有关。NAFLD是一种以肝细胞内脂质过度积聚为特征的疾病。如果动物没有得到及时治疗，NAFLD就可能从单纯性肝脂肪变性发展为非酒精性脂肪性肝炎，或者发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。动物超重、胰岛素抵抗、圈养、饮食模式改变、遗传因素以及肠道屏障功能的紊乱都有可能导致NAFLD[11]。

目前，脂肪肝动物模型的构建通常通过高脂、高糖、四环素等毒物或药物构建[12-13]；
而体外脂肪变性模型的构建通常采用油酸、脂肪酸、棕榈酸等处理方法[14-15]。本试验首先用不同浓度的油酸诱导BRL-3A细胞，经细胞活力测定分析发现，向细胞中添加(0.03、0.06、0.12、0.24、0.48)mmol·L-1油酸后，与对照组相比，只有0.48 mmol·L-1油酸对细胞有明显的抑制作用，证明0.48 mmol·L-1油酸对BRL-3A细胞毒性较大，并且通过显微镜观察发现细胞出现受损死亡等情况，而其他浓度的油酸对BRL-3A细胞无毒副作用。通过油红O染色进一步检测细胞总脂滴面积，发现与对照组相比，0.12和0.24 mmol·L-1油酸处理后细胞总脂滴面积极显著上升。转氨酶是肝损伤的主要标志物，主要由AST和ALT组成。其中，AST主要分布于心肌、肝、肾等组织，而ALT则主要分布于肝组织中[16]。医学上当超过5%脂肪堆积在肝中时，就称为脂肪肝。本试验油酸浓度为0.06 mmol·L-1时，TG含量就增加了一倍；
并且在0.12和0.24 mmol·L-1油酸处理后，TG含量极显著上升，同时AST和ALT活性皆升高，提示肝细胞出现损伤。所以结合上述细胞总脂滴面积结果，当油酸浓度为0.12 mmol·L-1，刺激时间为24 h，即可成功构建脂肪变性细胞模型。

短链脂肪酸是肠道菌群膳食纤维的主要代谢产物。乙酸、丙酸和丁酸是人类肠道中最丰富的短链脂肪酸[17]。短链脂肪酸不仅是代谢底物，也是调节肝代谢的信号分子[18]。乙酸是动物机体内最主要的短链脂肪酸之一，占体循环内短链脂肪酸含量的一半以上。乙酸除了能作为能量底物和碳源参与机体内代谢活动外，还对机体脂肪代谢、食欲调节和胰岛素抵抗等方面具有重要作用[19-21]。白鸽等[22]研究发现，向牛肝细胞中添加乙酸钠，会加速肝脂肪酸的氧化。本试验通过流式细胞术检测细胞凋亡率，发现不同浓度的乙酸钠对正常的BRL-3A细胞凋亡率均无影响，证明乙酸钠对细胞无毒副作用，可用于后续研究。进一步用4和8 mmol·L-1乙酸钠处理脂肪变性细胞模型后，均使细胞总脂滴面积、每平方毫米脂滴数、TG含量下降，AST和ALT活性皆下调，这与前人的研究结果一致。提示乙酸钠可以显著降低脂肪变性细胞模型的脂质堆积，缓解肝细胞损伤，具体机制有待进一步研究证实。

肝是调节脂质代谢、维持脂质稳态的重要器官。AMPK是肝细胞中能量的“传感器”和“调节器”。AMPK可调控脂质代谢酶的表达来调节肝脂质代谢。因此，AMPK信号通路在肝脂质代谢中起中心作用[23]。研究表明，乙酸可激活AMPK，AMPK进而上调肝中脂质氧化基因的表达，减少脂肪堆积[9,24-25]。小鼠肝特异性AMPK缺失导致血浆TG含量和肝脂肪生成增加[26]。AMPK还可以通过调控骨骼肌中葡萄糖摄取和游离脂肪酸氧化，抑制肝中的糖异生、糖酵解、脂肪生成和胆固醇形成[27]。本试验发现，用不同浓度乙酸钠处理脂肪变性细胞模型后，4和8 mmol·L-1乙酸钠均可激活AMPK信号通路关键蛋白。

TG是细胞内和血浆中脂肪酸储存和运输的主要形式。肝是脂肪酸代谢的中心器官，肝细胞通过从血浆中摄取和从头生物合成的方式在肝中积累脂肪酸[28]。脂肪酸的从头合成主要受相关关键酶所调控，其中，乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)可以将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A[29]；
脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，FAS)是催化脂肪酸从头生成的最后一步[30]；
SCD-1是单不饱和脂肪酸合成的关键调控因子[31]。而脂肪酸的分解代谢受CPT-1、CPT-2等酶的调控，主要是将脂肪酸转运到线粒体进行氧化分解，这是脂肪酸在β-氧化过程中的限速步骤[32]。本研究发现，用不同浓度的乙酸钠处理脂肪变性细胞模型后，4和8 mmol·L-1乙酸钠均会导致细胞ACC mRNA表达量显著下降；
8 mmol·L-1乙酸钠会导致FAS mRNA表达量显著下降；
而2、4、8 mmol·L-1乙酸钠均可使SCD-1 mRNA表达量显著下降。4和8 mmol·L-1乙酸钠会导致与脂肪酸分解代谢的相关酶CPT-1 mRNA表达量显著上调；
而8 mmol·L-1乙酸钠会导致CPT-2 mRNA表达量显著上调。提示，乙酸钠主要通过CPT-1促进了脂肪变性细胞模型胞液中脂肪酸转运到线粒体进行氧化分解，并且通过SCD-1进一步抑制了饱和脂肪酸催化合成单不饱和脂肪酸，进而降低了细胞中脂质的含量。以上结果表明，乙酸钠可通过AMPK信号通路调控脂肪变性细胞模型脂代谢关键酶的活性，促使脂肪酸的从头合成途径被抑制，激活脂肪酸的分解途径，进而减少BRL-3A细胞TG的合成。

油酸诱导的脂肪变性细胞模型，会造成肝细胞受到一定程度的损伤。而用不同浓度乙酸钠会通过AMPK信号通路促进脂肪酸的分解代谢，进而减少TG的合成，同时可以抑制肝细胞损伤，从而缓解脂肪变性所带来的负面影响，为今后NAFLD的治疗提供了新的理论依据和切入点。