rno-miR-161,靶向EGLN2,抑制血管性痴呆大鼠额叶铁死亡

周贤熙，周丽亭，马春媚，孔洁琛，苏俊芳，邓汝东，刘爱军，陈东风*

1.广州中医药大学基础医学院实验教学中心，广州 510006；
2.广州中医药大学附属湛江市第一中医医院，广东 湛江 524000；
3.广州中医药大学基础医学院人体解剖系，广州 510006

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是一种由大脑血流量减少而引发的认知功能障碍综合征，是常见的痴呆性疾病，约占全球痴呆患者的20%[1]。VD 会造成继发性神经元损伤和不可逆的组织损伤，导致患者出现不同程度的认知障碍和行为障碍，影响生活质量[2]。VD 的病理机制复杂，细胞死亡在VD 的发生发展中有重要作用[3,4]。铁死亡是一种新的细胞死亡形式。研究表明，铁死亡对中风、创伤性脑损伤和AD等神经系统疾病具有重要作用，抑制铁死亡具有明显的神经保护作用并可改善动物模型的认知障碍[5～7]，铁死亡参与VD 的病理过程，但其机制尚不清楚。近年来，microRNAs 与多种神经系统疾病的关系受到重视，被认为是诊断神经系统疾病的潜在标记物。microRNAs 是一种短的非编码RNA，通过多种机制参与VD 的病理过程[8]。研究表明，多种miRNAs 调控靶标蛋白参与VD 的病理过程[9]，但VD 与miRNAs 的研究十分有限。虽然miRNAs 和铁死亡均参与VD 的病理过程，但是两者的作用路径是否存在关联尚不清楚。本研究结扎大鼠双侧颈总动脉制备VD 大鼠模型，水迷宫行为学检测、双荧光素梅报告基因系统和siRNA 等方法，探索在VD 中，rno-miR-161 对铁死 亡的调控机制，以期为VD 的病理机制研究提供新的视角。

1.1 材料

24 只250～280 g 成年雄性SD 大鼠，购自广州中医药大学动物实验中心，按随机原则将大鼠分为假手术组（Sham 组）和模型组（VD 组），每组12 只。术前对大鼠进行适应性饲养1 周。

1.2 研究方法

1.2.1 VD 造模 100 mg/kg 氯胺酮和10 mg/kg 甲苯噻嗪腹腔注射麻醉动物，固定大鼠并允许其自主呼吸，颈部中线切口，暴露颈总动脉并将其与迷走神经分开，模型组永久结扎双侧颈总动脉[10]；
假手术组仅暴露颈总动脉但不进行结扎处理。手术过程大鼠体温保持36.5～37.5℃，直到动物从麻醉中恢复，再放回鼠笼饲养4 周。

1.2.2 Morris 水迷宫检测 对假手术组和模型组大鼠行Morris 水迷宫测试。（22±1）℃水填充圆形水池至30 cm 深，将水池分为4 个象限，在第3 象限正中放置直径为20 cm 的平台，没入水下1 cm。每天上午固定时间将小鼠面向池壁放入水中，记录90 s 内寻找平台的时间即逃逸潜伏期，连续5 d 进行定位航行实验。测试后，CO2窒息法处死大鼠。解剖显微镜下提取额叶，磷酸盐缓冲液（1X PBS）清洗。每一块额叶组织沿正中线分为两部分，一部分额叶组织10%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，拟行免疫组织化学染色；
另一部分浸入液氮冷冻，后续进行RT-qPCR 和western bloting检测。

1.2.3 免疫组织化学染色 额叶组织石蜡切片常规脱蜡入水；
一抗GPX4（编号ab 140595；
Abcam，英国）和EGLN2（编号ab71598；
Abcam，英国）工作液浓度为1：100，4℃孵育过夜；
生物素化二抗37℃孵育30 min，DAB 显色。光学显微镜（OLYMPUS DP27；
美国）X100 倍拍摄图像。每个组织块拍摄3 张非连续性图片、每张图片选择5个不同视野评估GPX4和EGLN2的表达。

1.2.4 RT-qPCR 检测 TRIzol 试剂提取大鼠额叶中总RNA（600 ng）。分光光度计（Nanodrop 2000，美国）测定RNA 的浓度和纯度。rno-miR-161 的特异性茎环引物用于RT-qPCR，U6 基因作为rno-miR-161 的内参基因，β-actin 基因作为EGLN2 和GPX4 的内参基因，基因的相对表达率使用2-ΔΔCt法计算。引物序列如表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Sequence of primers used for RT-qPCR

1.2.5 Western bloting 收集组织和细胞，RIPA 裂解液裂解30 min，12,000 rpm 离 心10 min，收集上 清液，-80℃下保存。BCA 试剂盒检测蛋白质浓度。SDS-PAGE 电泳分离总蛋白（30 µg），并转移至0.45µm PVDF 膜（EMD Millipore，美国）。室温5% BSA 封闭2 h，一抗4℃孵育过夜（EGLN2 目录号ab113077，1：1000；
GPX4 产品编号ab125066，1：1000；
β-actin 产品编号ab8226，1：5000，Abcam，英国），0.01% Tween-20 的TBST 缓冲液洗膜，二抗室温孵育2 h，发光液显色，Tanon-6200 凝胶成像系统（天能生物仪器有限公司，上海）图像采集。图像处理软件（ImageJ；
版本14.8）用于分析图像。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测 生物信息学（TargetScan，www.targetscan.org；
miRBase，www.mirbase.org）预 测rno-miR-161 的靶基 因。构 建psiCHECK-2-EGLN2-wild-type（WT）和psiCHECK-2-EGLN2-mutant（MUT）质粒（货号分别为G0172509 和G0172509-2，深圳华安平康生物科技有限公司）。Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）将psiCHECK-2-EGLN2 克隆载体（200 ng）转染PC12 细胞，转染24 h后，Dual-Luciferase Reporter 检测试剂盒（Promega Corporation，美国）对每个孔的荧光值进行定量。psiCHECK-2-EGLN2 质粒中，将rno-miR-161 的靶位点插入海肾荧光素酶（hRluc）的下游序列中。萤火虫萤光素酶用作内部参考和标准化。psiCHECK-2-EGLN2 载体转染的PC12 细胞用作阳性对照。每个实验重复3 次，数据以平均值±SEM 表示。

1.2.7 转染 将对数生长期PC12 细胞接种至6 孔板中（每孔5×105个细胞），培养1 d，分别转染rno-miR-161-mimic，miR-161-mimic NC，rno-miR-161-inhibitor、rno-miR-161-inhibitor NC 或siEGLN2-1、siEGLN2-2、siEGLN2-3，无血清培养基培养24 h，0.25%胰蛋白酶消化，离心，收集细胞沉淀，进行后续检测。3 条不同的siEGLN2 基因序列如表2。

表2 siEGLN2 基因序列Tab.2 Gene sequences of siEGLN2

1.3 统计

SPSS22.0 软件（IBM Corp，美国）用于统计分析，统计图形使用GraphPad Prism 制作（6.0 版；
GraphPad Software，美国），使用t检验用于分析两组之间的差异，单因素方差分析（ANOVA）分析多组之间的比较。P＜0.05 有统计学意义。

2.1 大鼠空间学习能力与记忆能力

大鼠双侧颈总动脉结扎后饲养4 周，Morris 水迷宫检测VD 大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数，结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠的逃避潜伏期显著增加，穿过平台位置的次数显著减少（P＜0.01）（图1），表明VD 大鼠的空间学习能力和记忆能力减弱，存在认知功能障碍和记忆障碍，VD 大鼠造模成功。

图1 VD 大鼠空间学习能力与记忆能力下降A：大鼠行为学实验时间线B：大鼠逃避潜伏期路线图C：大鼠逃避潜伏期的统计分析D：大鼠穿越平台次数的统计分析** P＜0.01 Sham：假手术组VD：模型组Fig.1 The impaired acquisition of spatial learning ability,memory ability in VD ratA：Timeline of the rats behavioral experiments; B: Representative movement traces of rat; C: The statistical analysis of escape latency; D: The statistical analysis of platform crossing times,**P＜0.01 Sham: sham group;VD: model group

2.2 大鼠rno-miR-161、GPX4 和EGLN2 表达

RT-qPCR 检测发现rno-miRNA-161 在VD 大鼠 额叶中的表达水平显著下降（P＜0.01）。免疫组织化学染色阳性为棕黄色，结果显示，与对照组相比，VD 大鼠额叶中EGLN2 的阳性表达升高，GPX4 的阳性表达下降（P＜0.001）。RT-qPCR 结果表明，与对照组相比，EGLN2 mRNA 表达升高（P＜0.001），GPX4 mRNA 表达降低（P＜0.05）。Western bloting 结果表明，在蛋白质水平，与对照组相比，EGLN2 的表达升高（P＜0.05），GPX4 的表达降低（P＜0.05）。这提示，rnomiRNA-161 的表达可能与EGLN2 和GPX4 存在联系。见图2。

图2 D 大鼠额叶rno-miR-161 和GPX4 的表达下降，EGLN2 表达上升A：rno-miR-161 在额叶的表达检测 ** P＜0.01 B：免疫组织化学检测EGLN2 和GPX4 的表达 *** P＜0.001 标尺10 µm C：EGLN2 mRNA 和GPX4 mRNA 表达分析* P＜0.05 *** P＜0.001 D：EGLN2 和GPX4 蛋白质表达分析*P＜0.05Fig.2 The expression of miR-161and glutathione peroxidase 4 (GPX4) in the frontal lobe of VD rat decreased,while the expression of EGLN2 increasedA: Detection of rno-miR-161 expression in the frontal lobe,**P＜0.01; B: The expression of EGLN2 and GPX4detected by immunohistochemical staining,***P＜0.001,Scale bar: 10 µm; C:Analysis of the expression of EGLN2 mRNA and GPX4 mRNA,*P＜0.05,****P＜0.0001; D:Analysis of the protein expression of EGLN2 and GPX4,*P＜0.05

2.3 rno-miR-161 与EGLN2 的关系

双荧光素酶报告基因系统验证发现，WT 组中，与rno-miR-161-minic NC 组相比，rno-miR-161-minic组荧光素酶活性降低（P＜0.05）；
与rno-miR-161-inhibitor 组 相比，rno-miR-161-inhibitor 荧光素酶活性增加（P＜0.05），MUT 组中各组无显著性差异，结果表明EGLN2 是rno-miR-161 的直接结合位点。见图3。

图3 rno-miR-161 特异性靶向EGLN2A：rno-miR-161 靶向EGLN2 位点分析B：双荧光素梅报告基因检测rno-miR-161 与EGLN2 靶向关系*P＜0.05Fig.3 The EGLN2 was the specific target of rno-miR-161A: Analysis of rno-miR-161 targeting EGLN2 site; B: Luciferase reporter gene detected the target relationship between rno-miR-161 and EGLN2,*P＜0.05

2.4 rno-miR-161 对EGLN2 表达的影响

分别用rno-miR-161-mimic、rno-miR-161-mimic NC、rno-miR-161-inhibitor 和rno-miR-161-inhibitor NC转 染PC12 细胞，RT-qPCR 检 测EGLN2 mRNA 的 表达，结果表明，在转录水平，与对照组相比，rno-miR-161-mimic 抑制EGLN2 表达（P＜0.05），rno-miR-161-inhibitor 促进EGLN2 表达（P＜0.001）。Western bloting检测EGLN2 蛋白质的表达，结果显示，与对照组相比，rno-miR-161-mimic 抑制EGLN2 蛋白质表达，rnomiR-161-inhibitor 促进EGLN2 蛋白质表达。表明rnomiR-161 抑制EGLN2 的表达（图4）。

图4 rno-miR-161 抑制EGLN2 表达A：EGLN2 mRNA 表 达分 析 *P＜0.05 *** P＜0.001 B：EGLN2 蛋 白质表达检测Fig.4 rno-miR-161 negatively regulated EGLN2 expressionA: The mRNA expression analysis of EGLN2,*P＜0.05,****P＜0.0001；

B: The detection of protein expression of EGLN2

2.5 EGLN2 对GPX4 表达影响

采用siRNA 技术构建siEGLN2-1、siEGLN2-2、siEGLN2-3 等3 条干扰片段，转染PC12 细胞，结果表明，与对照组相比，siEGLN2-2 抑制EGLN2 表达效果最显著（P＜0.0001）（图5），后续研究选用siEGLN2-2进一步研究。PC12 细胞分别转染rno-miR-161-mimic、siEGLN2 及rno-miR-161-mimic+siEGLN2，与对照组相比，rno-miR-161、siEGLN2 和共转染组GPX4蛋白表达水平均出现不同上调（P＜0.05）。表明rnomiR-161 特异性靶向抑制EGLN2 表达促进铁死亡。

图5 干扰EGLN2 后GPX4 表达上调A：以3 条不同的siEGLN2 干扰检测EGLN2 mRNA 表达水平**** P＜0.0001 B：3 条不同的siEGLN2 干扰检测EGLN2 蛋白质表达水平C：GPX4 蛋白质表达分析*P＜0.05Fig.5 The expression of GPX4 was up-regulated after EGLN2 interferenceA: EGLN2 mRNA expression level was detected by three different siEGLN2 interference fragments,****P＜0.0001; B: EGLN2 protein expression level was detected by three different siEGLN2 interference fragments; C:The protein expression analysis of GPX4,*P＜0.05

VD 是一类严重影响患者生活质量的重大疾病，科学家们对VD 进行了广泛而深入的研究，但目前人们对VD 的病因、病机及治疗的认识仍比较有限[4]。本研究采用VD 大鼠模型探索rno-miR-161 在VD 中的作用发现，VD 大鼠额叶中，rno-miR-161 的表达下降；
EGLN2 是rno-miR-161 的直接靶标；
抑制EGLN2的表达促进GPX4 的表达水平，抑制铁死亡。结果表明，在VD 中，rno-miR-161 靶向EGLN2 调控GPX4 的表达，进而调控铁死亡（图6）。

图6 rno-miR-161 抑制EGLN2 调控铁死亡路线图Fig.6 Schematic summary of the role of rno-miR-161 in the regulation of ferroptosis

VD 的病理机制复杂，与炎症反应、氧化应激、Aβ异常沉积等多个病理机制有关[1,4]。近年来关于miRNAs 在痴呆类疾病方面的研究取得很大进展，miRNAs 作为重要的生物标志物，在多种神经系统疾病中发挥重要作用。本团队的前期研究发现多种miRNAs 参与VD 的病理过程。其中，miR-210-5p 靶向Snap25 参与VD 的病理过程[11]；
在VD 中，miR-335调控ROCK2 的表达，促进应急颗粒形成，抑制细胞凋亡[12]；
Liu 等人[13]的研究表明，miR-134-5p/Foxp2/Syn1同样参与VD 的病理过程。本研究发现了新的miRNA（rno-miR-161）参与VD 的发生发展过程，可为VD 临床治疗提供新的诊断标志物和理论依据。

miRNAs 通过调控靶标蛋白参与各种疾病的发生发展。本研究结果揭示rno-miR-161 靶向EGLN2 促进铁死亡，EGLN2 是rno-miR-161 的靶标蛋白。EGLN2 调控的HIF1A 是调控机体氧化还原反应和脂质活性氧的主要的信号通路之一，而大脑富含不饱和脂肪酸的脂质，是产生脂质活性氧的关键底物，容易因氧化还原反应失衡而受到氧化应激的影响[14]，因此，下一步应重点关注VD 中EGLN2-HIF1A 介导的铁死亡和rno-miR-161 之间的关系。其次，本研究结果限于细胞水平。在体内，抑制EGLN2 能否减缓大脑铁死亡的水平需要更多的数据支持。

现有的研究关注miRNAs 或铁死亡单个因素在VD 中的作用，缺乏两者共同作用的机制研究[6]。本研 究初 步阐明在VD 中，rno-miR-161 介导EGLN2 调控铁死亡的作用机制，有助于了解miRNAs 和铁死亡共同参与VD 的机制。铁死亡是一种铁和脂质过氧化反应依赖的细胞死亡形式，由于其与神经系统性疾病存在紧密联系，被认为是治疗痴呆类疾病的潜在手段[15]。最新的研究结果表明，抑制铁死亡改善VD 大鼠认知功能[5,7]，但铁死亡参与VD 的作用机制缺乏足够的实验数据支持。本研究结果表明，GPX4 作为铁死亡的关键调节蛋白，EGLN2 抑制GPX4 的表达，促进铁死亡，EGLN2 表达升高与铁死亡相关，这为铁死亡参与VD 的机制研究提供新的视角。

综上，本研究揭示了在VD 中，rno-miR-161-EGLN2 与铁死亡之间的关系，表明miRNAs 介导铁死亡参与VD 的病理过程，有助于更全面了解VD 的病理机制，为缓解VD 提供潜在的治疗新思路。