间充质干细胞治疗严重烫伤的研究进展

杨仁生，庞荣清

(1.联勤保障部队第九二〇医院干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室 云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室 昆明市干细胞与再生医学重点实验室 基础医学实验室，昆明 650032；

2.昆明医科大学，昆明 650500)

烫伤是指由沸水、蒸汽等热力所致的组织器官损伤，是常见且复杂的创伤疾病之一[1]，是严重的世界性公共卫生问题[2]。烫伤可损伤皮肤，严重烫伤往往引发机体全身炎症反应，甚至因多器官功能障碍综合征(multi-organ dysfunction syndrome，MODS)而导致死亡[3]。目前，严重烫伤的主要治疗策略是抗休克治疗、抗感染治疗、皮肤创面修复治疗以及维持器官功能的对症支持治疗[4]，但疗效不佳。一方面，这些治疗方法在皮肤修复中难以实现，因为没有合适的皮肤可以移植，且难以保证移植成功[5]；
另一方面，这些治疗方法与严重烫伤后的病理生理变化相互矛盾[6]。而间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)生物学研究的不断进展为严重烫伤治疗带来新的希望[7-10]。因此，研究探索MSC调节严重烫伤引发的免疫功能紊乱[10]、修复皮肤创面[5]和组织[11]的技术方法及其作用机制显得十分紧迫。现就MSC治疗严重烫伤的研究进展予以综述，通过分析烫伤模型的选择与MSC治疗结合综合考虑研究方案的必要性，展望借助高通量技术方法深入开展MSC治疗严重烫伤系列研究的前景。

皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，包括血管、毛囊和汗腺等附属物[12]，是机体将外部环境与内部器官分开的重要屏障。当皮肤受到严重烫伤后，一方面，热力效应直接破坏皮肤组织结构，导致组织渗透性增加，大量液体渗出，循环血量明显减少，引起器官组织缺血缺氧，导致肺、肝等主要器官的功能障碍和损害[13]；
同时，严重烫伤会引起全身应激性反应，尤其是胃肠道的应激性损伤，造成黏膜组织细胞的变性、坏死、脱落，直接破坏胃肠道黏膜屏障功能[14]，微生物趁机移位进入血液循环，形成肠源性的内毒素血症[15]。肠源性的内毒素血症是严重烫伤后导致多器官功能衰竭的重要原因之一。另一方面，大面积烫伤后，若不进行手术治疗，创面持续存在，残留的坏死组织及大量渗液为皮肤表面的大量微生物异常生长提供了良好条件，当创面上的微生物达到一定浓度时，微生物趁机侵袭机体焦痂深层，并不断侵袭邻近的健康组织，导致严重外源性感染[16]。可见，严重烫伤本质上是局部直接组织损伤并发远端多器官组织炎性损伤。其主要病理生理机制是毛细血管网通透性增加，激活机体神经内分泌和免疫系统[17]，释放大量应激激素和炎症介质，逐步发展为“细胞因子风暴”或“瀑布效应”[18-19]。在此基础上，内外源性感染发生，微生物及其细菌毒素进入血液循环形成菌血症或脓毒症，机体在两次打击下极易引发全身炎症反应综合征，甚至发展为MODS[3]。

由此可见，机体受到严重烫伤后，从皮肤损伤到MODS是一个不断发展演变递进的过程。研究观察严重烫伤后的病理生理发展变化规律，针对关键发展环节，探索延缓或阻断某个关键环节的发展进程，最大限度地减轻、延缓或阻止严重烫伤后引起的免疫功能紊乱、缓解脏器功能损伤，有可能降低以MODS为病理生理特征的急危重症患者的死亡率。因此，从烫伤引起的MODS发病机制出发，以某个关键发展环节为切入点，深入探讨严重烫伤的干细胞治疗策略具有非常重要的科学意义和潜在的应用价值[20-21]。

MSC是一类起源于中胚层，具有自我更新和多向分化潜能的不成熟细胞，可以从骨髓、脂肪、脐带和胎盘等器官或组织中分离获取[22]。众多干细胞生物学研究证实，MSC不表达主要组织相容性复合体Ⅱ、CD40和CD80等共刺激分子[12,23-24]，即MSC具有低免疫原性，可以异体甚至异种移植用于临床治疗。MSC可抑制淋巴细胞的增殖反应[25]，直接抑制淋巴细胞增殖，还可分泌多种活性因子参与免疫网络调节[26]，从而减轻炎症反应，避免了由糖皮质激素抗炎治疗引发的机体免疫功能紊乱和抗生素治疗导致的机体肠道菌群的异位和失调，从而加重机体的感染；
同时MSC还具有归巢和分化功能，促进皮肤组织和脏器组织修复，从而恢复脏器功能[27]。MSC的这些独特生物学特性使得异体移植MSC治疗严重烫伤成为可能。

2.1基于全身免疫调节的MSC治疗 虽然MSC对机体烫伤的免疫调节机制尚不完全清楚，但目前普遍认为MSC主要依赖于细胞与细胞间的直接接触或旁分泌免疫调节介质两种方式来发挥免疫调节作用。研究表明，MSC可使巨噬细胞从炎症的M1表型转变为修复性抗炎M2表型[4,7-8]，使伤口产生抗炎性细胞因子[白细胞介素(interleukin，IL)-10][7]，减少促炎性细胞因子(肿瘤坏死因子-α)[9]。另一研究也显示，MSC治疗烫伤模型可以持续减少炎症细胞因子(高迁移率族蛋白B1、IL-6和肿瘤坏死因子-α)的生成，而增加抗炎性细胞因子(IL-10)的生成[10]。说明MSC至少具有通过以IL-10为核心的平衡途径正向调节机体免疫功能的作用。进一步研究发现，在创伤微环境中，促炎性细胞因子可以刺激MSC分泌一氧化氮、前列腺素E2和吲哚胺2,3-双加氧酶等介质[28]，通过影响免疫细胞的增殖及分化，发挥免疫调节作用，如转化生长因子-β和前列腺素E2可抑制T细胞产生IL-2，抑制辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)0分化为Th1细胞，促进Th1细胞向Th2细胞转化，抑制自然杀伤细胞、M1型巨噬细胞和B细胞等促炎免疫细胞的增殖和分化，促进M2型巨噬细胞和调节性T细胞等抗炎免疫细胞的增加[12,29-30]。MSC的这些调节作用中有一个重要的作用机制是可以调节p38促分裂原活化的蛋白激酶和核因子κB P65 蛋白的磷酸化水平，在烫伤中可激活肝脏库普弗细胞，MSC可以在严重烫伤下通过分泌肿瘤坏死因子-α刺激基因6，从而减轻机体的炎症反应[10]。

根据严重烫伤的病理生理进展，结合MSC生物学功能方面的实验发现，利用MSC的免疫调节功能治疗严重烫伤是可行的，但目前的研究主要表明MSC治疗起到了调节免疫功能的作用，并揭示了部分作用机制，迫切需要在掌握严重烫伤后病理生理发展变化规律的基础上，进一步广泛研究MSC的免疫调节作用及其更全面的免疫调节网络机制，尤其应该注意负向调节机制研究。以此为切入点，从免疫调节疗效角度深入探索MSC的体外预处理方案以及细胞治疗的时机和细胞治疗剂量对烫伤治疗的影响，有望最大限度地纠正严重烫伤后免疫功能失衡。这可以在一定程度上延缓或阻止机体全身炎症反应甚至预防MODS的发生，从而降低严重烫伤患者的死亡率[31]。

2.2基于外泌体的MSC治疗 MSC除了分泌多种活性因子及介质外，还能分泌外泌体发挥生物学作用。外泌体是一种由真核细胞的多泡体与胞膜融合后释放到胞外的纳米级膜性小囊泡[32]，其作为信号分子载体，可以在不同细胞间进行信息传递及细胞大分子间的传递，调节细胞间的信号转导，参与疾病的发生发展，将生物分子传递到受体细胞发挥多种生物学功能[33]。MSC能够通过外泌体将巨噬细胞暴露于微RNA来调节炎症反应，这些RNA结合到免疫细胞中并抑制促炎性细胞因子的分泌。然后通过免疫细胞之间的这些微RNA的交换来传递信息，进一步调节免疫系统[34]。同时，MSC来源的外泌体还可以促进伤口的血管生成素2上调，进而增强损伤区域血管内皮细胞的增殖、迁移、成管能力，从而促进血管生成，加快伤口愈合[35]。MSC的免疫调节作用与分化修复作用并不是孤立存在的，如MSC释放的外泌体除了促进血管生成，还可通过极化M2型巨噬细胞来减轻黏膜炎症，维持小鼠肠道结构的完整性[36]。可见，外泌体是MSC临床转化应用的延伸。外泌体远小于MSC，大剂量使用不会导致肺栓塞，更重要的是可以制成注射液，目前已经有外泌体直接注射、静脉注射、腹膜内注射、口服给药和基于水凝胶的包埋研究，已经被用来治疗不同的疾病模型[37]。在战争条件下，燃烧弹、火焰喷射器等武器的使用更易集中出现大量严重伤病员，MSC来源的外泌体注射液的成功开发，使得野战条件下使用成为可能。

2.3基于组织修复的MSC治疗 MSC治疗严重烫伤的另一个重要机制是干细胞的分化和修复功能。基础研究表明，移植进入体内的MSC可以在趋化因子的引导下靶向迁移到烫伤创面及机体组织中定植，在特定微环境条件下分化为相应的组织细胞，如皮肤细胞等[2,38]。有研究发现，介导MSC靶向迁移的是炎症组织中的基质细胞衍生因子1，呈梯度分布的基质细胞衍生因子1会引导更多的MSC向受损部位迁移[9,12]，并分化为功能组织细胞以替代受损细胞[12]。MSC可通过旁分泌机制分泌多种生长因子和诱导因子，激活机体原位干细胞分化成熟，促进伤口快速愈合[9]。同时，MSC还可分泌乳酸盐，使巨噬细胞极化转变为修复性抗炎M2型巨噬细胞，从而增加抵抗素样分子α和整合素(CD11b)的表达，其中抵抗素样分子α可抑制炎症反应的发展，促进新生血管的生成和成肌纤维细胞的增殖和分化，进而促进伤口的愈合[39]；
CD11b可诱导IL-10的表达，通过多途径调节伤口炎症反应，并通过抑制T细胞增殖抑制长时间炎症引起的皮肤纤维化[40]，从而抵御外界病原微生物的侵入，预防炎症进一步加重。此外，MSC还广泛参与肠[36]、肺[41]和肝[25]等器官损伤修复，并通过修复组织器官缓解内源性感染，促进皮肤愈合预防外源性细菌侵入机体进一步加重全身炎症反应。因此，开展MSC修复严重烫伤组织研究，需要复制不同损伤程度的模型，并开展不同途径的细胞给药比较研究。

从上述分析可知，开展MSC治疗烫伤研究必须首先建立一个稳定、规范化、符合临床要求的烫伤动物模型。从实验动物的特点来看，猪的皮肤组织结构和生化指标与人极其相似[1，20]，体型大小也更适于皮肤移植的手术操作，但实验成本相对较高，且难以大批量复制模型用于细胞剂量筛选等研究。小鼠个体太小，血管太细，而MSC直径较大，当静脉输注MSC进入血管时，细胞数量稍多易造成梗死，不太适于开展MSC静脉输注治疗研究。因此，烫伤动物模型最常用大鼠和兔[42-44]。

从MSC治疗实验设计来看，利用金属棒[45-48]直接接触动物皮肤造成局部皮肤不同程度损伤的方法简便易行，容易精准控制烫伤作用时间、创面形状和面积，便于批量复制烫伤动物模型，但因为金属烫头与皮肤之间容易导致致伤压力不均、局部高温容易造成表皮凝固性坏死而不利于热力效应向深层传播、金属烫头容易快速降温，故这类局部烫伤的动物模型均一性不好，不易诱发全身应急性损伤，较适于小样本局部皮肤创面修复的治疗观察研究。直接接触热水致伤的方法[29，39]容易控制水温，但不好控制烫伤皮肤的形状和面积，且水温最高100 ℃，易导致表皮凝固性坏死，不利于热力效应向深层传播，同样相对不易诱发全身应急性损伤。而蒸汽温度远超100 ℃，即便在海拔1 890 m的昆明地区也可高达110 ℃，且热力效应穿透力极强，蒸汽作用时间极易精准控制，特别容易造成大面积皮肤深度损伤，如果辅以特定的蒸汽产生装置和特定的皮肤保护模具[7]，很容易短时间内批量制备不同创面大小或不同烫伤程度的均一烫伤模型，很容易诱发局部组织变性坏死和全身性炎症反应，特别适于开展局部皮肤组织MSC修复治疗、MSC系统性预防和治疗效果评价以及治疗机制研究，同时获得的模型也可用于研究观察MSC生存演变规律。

回顾MSC治疗烫伤的相关研究发现，不同实验研究的结果不适合进行比较，因为制作烫伤模型差异较大，如热水致伤大鼠模型水温差异太大，故动物模型病理生理变化差异也很大。因此，在开展MSC治疗烫伤研究时，应充分考虑不同制备方法获得的烫伤动物模型的病理生理变化特点、将动物模型制备与MSC治疗方案结合起来综合考虑设计研究方案，如研究MSC预防或治疗严重烫伤引发的全身性炎症反应时，只有选择蒸汽致伤这类致伤严重的模型，才能模拟从皮肤损伤到MODS的过程，也才能探索延缓或者阻断某个关键环节发展进程的切入点，在构思科研立项时，才能找准需要解决的科学问题，也才更有利于从不同角度深入推进MSC治疗严重烫伤的系列研究。事实上，目前MSC治疗烫伤的研究，最需要的就是基于从皮肤损伤到MODS的动态发展变化规律的认识、借助各种高通量检测分析技术手段开展的非现象观察的深层次研究，有望理清严重烫伤引发的免疫功能紊乱以及MSC调节的十分复杂的调控网络机制和因果关系，以为将来临床转化应用提供理论依据。

MSC在严重烫伤中发挥重要作用，可以利用其生物学功能调节炎症反应、促进创面血管新生、促进创面愈合。鉴于目前严重烫伤的治疗效果尚不满意的现状，结合严重烫伤的病理生理变化特点，充分运用MSC基础研究的最新成果，建立合适的动物模型研究开发严重烫伤等以MODS为病理生理特征的急危重症治疗新技术具有重要意义。但是MSC的输入途径、剂量、时间仍需要明确，未来应进一步了解MSC的功能及其机制，以为临床治疗严重烫伤提供理论依据。