5种柑橘属药材中黄酮差异比较

吴梦玫， 马舒婷， 钟楚楚， 吴孟华,3， 张 英,3， 曹 晖,3， 马志国,3*

(1.暨南大学岭南传统中药研究中心，广东 广州 511400；
2.国家中药现代化工程技术研究中心岭南资源分中心，广东 广州 511400；
3.广东省中医药信息化重点实验室，广东 广州 511400)

柑橘属植物是临床常用理气类药材的重要来源[1]，2020年版《中国药典》一部收载的枳实、枳壳、青皮、陈皮、化橘红、佛手等药材的基原植物均来自该属[2]，含有黄酮、香豆素、萜类、生物碱等成分[3]，其中柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、桔皮素等黄酮是一类重要的活性物质[4-6]，对其成分分析是单一药材的不同商品规格，或2种基原一致、采收期不同药材的多指标定性定量分析与指纹图谱对比[7-12]，文献[13]采用HPLC法对6种柑橘属药材指纹图谱同时进行比较，并初步将其分为柚皮苷型、橙皮苷型，但批次较少，而且未对主要成分色谱峰的结构类型和分布规律进行系统分析。因此，本实验建立枳实、枳壳、青皮、陈皮、化橘红5种柑橘属药材的HPLC指纹图谱，并结合化学计量学分析其基原与黄酮结构类型的相关性，以期为该属药材的品种鉴别和质量评价提供科学依据。

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，配置G7115A型DAD检测器、G7129A自动进样器和柱温箱、G7111A在线真空脱气机(美国Agilent公司)；
FA2204B电子天平(万分之一，上海佑科仪器仪表有限公司)；
EX225DZH电子天平(十万分之一，美国奥豪斯仪器有限公司)；
KQ5200DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

新北美圣草苷(批号X-080-181219)、芸香柚皮苷(批号Y-071-180917)、柚皮苷(批号Y-006-171216)、新橙皮苷(批号X-010-171216)、香蜂草苷(批号X03402001007)、枳属苷(批号G-019-171216)、川陈皮素(批号C-015-180306)、桔皮素(批号J-022-180730)对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均大于97.0%；
橙皮苷(批号BBP00425)对照品购自云南西力生物技术有限公司，纯度大于98.0%。乙腈、甲酸均为色谱纯；
其他试剂均为分析纯；
水为华润怡宝纯净水。

枳实、枳壳、青皮、陈皮、化橘红共62批，经暨南大学药学院马志国教授鉴定为正品，具体信息见表1。

表1 样品信息

2.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；
流动相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～10 min，15%B；
10～15 min，15%～20%B；
15～20 min，20%～25%B；
20～30 min，25%～40%B；
30～40 min，40%～50%B；
40～50 min，50%～60%B；
50～60 min，60%～65%B)；
体积流量1.0 mL/min；
柱温30 ℃；
检测波长283 nm；
进样量10 μL。

2.2 供试品溶液制备 取干燥药材粉末(过5号筛)约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超声(功率700 W，频率40 kHz)处理30 min，放冷，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一份供试品溶液(ZQ-1)，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，以新橙皮苷(5号峰)为参照，测得各特征峰相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于0.2%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液(ZQ-1)，于0、2、4、8、12、16、20、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，以新橙皮苷(5号峰)为参照，测得各特征峰相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于0.7%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批药材(ZQ-1)，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以新橙皮苷(5号峰)为参照，测得各特征峰相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于1.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 图谱建立 取各批药材粉末(过5号筛)适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，所得图谱以AIA格式导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012年版)”，见图1，并计算相似度，见表2，可知药材相似度较高，质量稳定。另外，基原均为酸橙的枳壳、枳实(酸橙)HPLC指纹图谱基本一致，均为橘成熟期不同的青皮、陈皮与枳实(甜橙)HPLC指纹图谱基本一致，为化州柚或柚的化橘红与其他药材HPLC指纹图谱的差异明显。

表2 7批样品相似度

2.4 共有峰指认 精密称取新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香蜂草苷、枳属苷、川陈皮素、桔皮素对照品适量，置于量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，得到不同质量浓度的对照品溶液，分别精密吸取10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图2。通过比对保留时间、紫外光谱图、对照品，共指认出9个共有峰，其中川陈皮素、桔皮素为黄酮苷元，其他7种为黄酮苷，并且芸香柚皮苷与柚皮苷、橙皮苷与新橙皮苷、香蜂草苷与枳属苷互为同分异构体。

2.5 共有峰化学类型分析 新北美圣草苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷所连接糖基均为芸香糖，由鼠李糖(1，6)葡萄糖构成；
柚皮苷、新橙皮苷、枳属苷所连接糖基均为新橙皮糖，由鼠李糖(1，2)葡萄糖构成，故可将上述成分分为新橙皮糖型、芸香糖型，而且在不同药材中呈现一定的分布规律。另外，新橙皮糖型黄酮苷是以酸橙为植物基原的枳壳、枳实(酸橙)及以柚为植物基原的化橘红中最主要的黄酮苷类成分，而芸香糖型黄酮苷以是甜橙和橘为植物基原的枳实(甜橙)、青皮、陈皮中最主要的黄酮苷类成分，故根据5种柑橘属药材HPLC指纹图谱的差异和共有峰的分布特点，可将其分为新橙皮糖型[枳壳、枳实(酸橙)、化橘红]、芸香糖型[枳实(甜橙)、青皮、陈皮]。

2.6 主成分分析(PCA) 将9个共有峰峰面积值输入SIMCA 14.1软件，对数据进行标准化处理，模型自动提取4个主成分，以综合特征值大于1、贡献率大于85%为标准[14]，当提取前4个主成分时，特征值均大于1，累积贡献率大于85%，累积模型解释率R2X为0.900，累积模型预测能力Q2X为0.618，即模型可解释90.0%的原始信息，而且R2X、Q2X均大于0.500，表明模型预测性良好，稳定可靠。以各药材批次为观察值，提取前2个主成分，使样品多维数据转化成二维数据，从而简化样本信息，见图3～4。

由图3可知，5种药材分为2类，枳实(甜橙)、青皮、陈皮为1类，即芸香糖型；
枳壳、枳实(酸橙)、光橘红、毛橘红为1类，即新橙皮糖型。由于4种新橙皮糖型药材所含成分种类和含量差异较大，故又可进一步分为2组，即枳壳、枳实(酸橙)组和光橘红、毛橘红组。

PCA载荷图中每种成分都对应1个点，载荷反映了变量与主成分之间的相关性，得分图中的标识与载荷图中相同位置分布的标识成正相关，与相反位置分布的标识呈负相关[15]。由图4可知，枳实(甜橙)、青皮、陈皮中芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷等成分贡献率大，枳壳、枳实(酸橙)中新北美圣草苷、枳属苷、新橙皮苷等成分贡献率大，光橘红、毛橘红中未知峰10、11等成分贡献率大，柚皮苷在枳壳、枳实(酸橙)及光橘红、毛橘红中等成分贡献率大。

本实验首次建立5种柑橘属药材HPLC指纹图谱，并对其主要特征峰进行了指认，发现均一性较高，质量稳定，部分基原植物相同或相近的药材之间成分差异小；
新北美圣草苷(1号峰)是枳壳、枳实(酸橙)特有峰，柚皮苷是化橘红中含量最高的成分，川陈皮素(7号峰)、桔皮素(8号峰)是区分化橘红与其他4种同属药材的特征成分；
在2种规格的化橘红中，10号峰是区分光橘红与毛橘红的特征成分，可能是橙皮内酯水合物，而11号峰可能是柚皮素[12]。主成分分析结果显示，可将主要含新橙皮糖型黄酮苷的枳壳、枳实(酸橙)、光橘红、毛橘红与主要含芸香糖型黄酮苷的青皮、陈皮、枳实(甜橙)分为2类，同属枳壳、枳实(酸橙)与光橘红、毛橘红又可被进一步分为2类。

黄酮为柑橘属药材主要成分，是以C6-C3-C6为骨架的一类化合物为基本母体衍生的化合物，大多以苷类形式存在，其中组成黄酮苷的糖类主要有D-葡萄糖、D-半乳糖、龙胆二糖、芸香糖、新橙皮糖等，组成芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷的糖均为由鼠李糖(1，6)葡萄糖构成的双糖芸香糖，组成新北美圣草苷、柚皮苷、新橙皮苷、枳属苷的糖均为由鼠李糖(1，2)葡萄糖构成的双糖新橙皮糖。糖基不同的2类成分在柑橘属药材中的分布具有一定的规律，芸香糖型黄酮苷主要分布在枳实(甜橙)、青皮、陈皮中，而新橙皮糖型黄酮苷主要分布在枳壳、枳实(酸橙)、化橘红中。

柑橘属植物最大的特点是可进行种间杂交，故其品种繁多，但大多来源于橘、柚、香橼，其中化橘红基原为柚，陈皮、青皮基原为橘，枳壳、枳实(酸橙)基原为酸橙，枳实(甜橙)基原为甜橙，酸橙、甜橙的2个亲本都是柚类与橘类，并且前者是由橘(父本)和柚(母本)一次杂交形成[11]，而后者是柚的基因持续不断渗入橘的基因组形成，在此过程中发生了多次杂交，由于一定程度上人工驯化选择，最终其亲本主要贡献度来自于橘类。因此，枳实(甜橙)HPLC指纹图谱与来源于橘的青皮、陈皮基本一致，而与来源于酸橙的枳壳、枳实(酸橙)差异明显。