桉树枝瘿姬小蜂与寄主及寄生蜂体内细菌相似性研究

郭春晖，王蕊蕊，马洪轩，彭 欣，王瀚棠，周 静，丁芷柔，王 雪，杨振德

(1 广西大学 林学院 广西高校林业科学与工程重点实验室，广西 南宁 530004；
2 广西国有高峰林场，广西 南宁 530000)

桉树枝瘿姬小蜂(LeptocybeinvasaFisher & LaSalle)属膜翅目(Hymenoptera)小蜂总科(Chalcidoidea)姬小蜂科(Eulophidae)，是一种严重危害多种桉树的入侵性致瘿害虫[1-3]。桉树枝瘿姬小蜂取食桉树嫩叶汁液，并产卵在桉树的嫩枝及叶柄处危害桉树生长，严重时可导致桉树死亡[1-3]。桉树枝瘿姬小蜂起源于澳大利亚，于2000年首次发现于中东和地中海地区，随后在亚洲、欧洲、非洲、大洋洲和美洲等45个国家和地区相继报道该害虫[1-3]。随着气候的不断变暖以及人类活动的加剧，桉树枝瘿姬小蜂还有继续扩散的趋势[1-6]。在中国，桉树枝瘿姬小蜂首次发现于中越交界处的广西壮族自治区东兴市，随后该虫迅速扩散入侵到包括广西，海南，台湾，广东，福建，江西，四川，云南和湖南等多个地区，造成了巨大的经济损失[5,7-13]。目前，关于桉树枝瘿姬小蜂体内的微生物已经有了一些研究，如Guo等[14]研究发现，不同性别桉树枝瘿姬小蜂体内细菌群落结构不同，立克次氏体(Rickettsia)为雌虫的优势菌；
Nugnes等[15]研究发现，桉树枝瘿姬小蜂体内存在两个不同种的立克次氏体，主要位于雌虫卵巢处，并认为与桉树枝瘿姬小蜂的繁殖有关；
王蕊蕊等[12-13]利用传统分离方法发现，桉树枝瘿姬小蜂体内的细菌会受到季节的影响，夏季可以分离出更多的细菌。此外，桉树枝瘿姬小蜂体内的细菌还能够降解桉树的次生代谢物质，有助于其顺利入侵定殖[16]。

昆虫体内包含大量的微生物，包括真菌、细菌和病毒等[17-19]。在长期协同进化过程中，许多微生物与宿主昆虫形成密切关系，并对宿主的繁殖、生存、群落相互作用、以及抵御捕食性和寄生性天敌的能力产生了巨大影响[20-23]。鉴于微生物的重要功能，昆虫与其体内微生物之间的关系成为当今的研究热点之一。外界环境中的微生物能够随着食物进入昆虫体内，比如中华按蚊(Anophelessinensis)体内的细菌主要来源于生存的水体环境[24]；
取食相同食物的舞毒蛾(Lymantriadispar)体内细菌结构具有高度的相似性，而取食不同食物时其体内细菌群落组成就会明显不同[25]。

为此，本研究利用高通量测序技术，对寄主桉树、桉树枝瘿姬小蜂及其寄生蜂孟氏胯姬小蜂体内的细菌进行研究，分析其内生细菌的多样性和群落构成，并比较三者体内细菌组成的相似性，旨在为后续深入研究桉树枝瘿姬小蜂、寄主桉树及其天敌孟氏胯姬小蜂三级营养关系，以及其体内细菌的传递模式、协同进化关系提供理论依据。

1.1 供试材料

桉树叶柄和主脉、无羽化孔虫瘿组织、桉树枝瘿姬小蜂幼虫和雌成虫(南宁种群)，均采自广西大学林学院校内教学实践基地(22°51′ N，108°17′ E)种植的巨园桉DH201-2(Eucalyptusgrandis×E.tereticornis)；
桉树枝瘿姬小蜂雌成虫(四川种群)和天敌孟氏胯姬小蜂成虫，采自攀枝花仁和镇(26°49′ N，101°75′ E)巨园桉DH201-2。每个样本的桉树叶柄和主脉、无羽化孔虫瘿组织各0.6 g。桉树枝瘿姬小蜂幼虫在无菌室中通过解剖无羽化孔的虫瘿组织获得。桉树枝瘿姬小蜂幼虫、刚羽化的雌成虫(南宁种群和四川种群)和天敌孟氏胯姬小蜂成虫进行饥饿处理6 h后，各选取50头大小一致、生长健康的个体作为一组样本，先用无菌水冲洗掉虫体表面杂质，再用75%酒精消毒1 min，随后用无菌水冲洗1 min，重复3次。

1.2 试剂与仪器

试剂：PowerSoil®DNA Isolation kit (MO BIO，12888-100)、Qubit®dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，Q32854)、MinElute®PCR Purification Kit (Qiagen，28004)等，均购自南宁国拓生物科技有限公司。

仪器：电泳仪电源(DYY-4C)和水平电泳仪(DYCP-31CN)，北京六一生物科技有限公司；
微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop One)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
PCR仪(EASYCYCLER 96)，德国耶拿分析仪器股份公司；
凝胶成像系统(CHEMIDOC XRS)，伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.3 细菌基因组DNA提取与PCR扩增

将1.1节准备的各个样本采用PowerSoil®DNA Isolation kit (MO BIO，12888-100)试剂盒进行内生菌基因组DNA提取，具体方法参考试剂盒说明书的步骤进行。采用微量核酸蛋白测定仪测定总DNA的浓度和纯度，检测合格后的样本保存于-80 ℃备用。

以提取的DNA为模板，采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增细菌16S rRNA的V3-V4区。扩增条件：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；
72 ℃延伸7 min。PCR扩增体系：DNA模板2 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL，正反向引物各1.5 μL，dNTP 1 μL，10×Buffer和High GC Enhancer各10 μL，用ddH2O补足50 μL。PCR产物用1.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4 细菌基因组DNA文库的构建和测序

利用Qubit®dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，Q32854)对上述PCR产物进行定量，用1.8%琼脂糖凝胶电泳切取目的片段，利用MinElute®PCR Purification Kit (Qiagen，28004)回收目的片段。使用Qubit 3.0荧光定量仪对按照建库说明构建好的小片段文库进行浓度检测，采用Agilent 2100 Bioanalyzer检测其片段范围，Illumina HiSeq 2500进行双末端测序(北京百迈克生物科技有限公司)。

1.5 数据分析

使用Overlap对测试得到的原始标签进行过滤，拼接并去除嵌合体，得到高质量的有效序列(effective Tags)。首先使用FLASH v1.2.11软件对每个样本的reads进行PE reads拼接，得原始Tags序列；
再使用Trimmomatic v0.33软件进行过滤，得到高质量的clean Tags序列；
最后使用UCHIME v4.2软件鉴定并去除嵌合体序列，得到有效序列，并计算其碱基质量值。碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，其计算公式为Q=-10lgP，其中Q为碱基质量值，P为概率；
碱基质量值(Q)越高表明碱基被测错的概率(P)越小，Q20和Q30分别代表碱基识别正确率大于99%和99.9%，其值越大，说明测序结果越好。

使用QIIME v1.8.0软件对这些序列进行聚类，相似性大于97% 的序列归为一个分类单元，即一个OTU(operational taxonomic unit)。使用Mothur v1.30(http://www.mothur.org/)软件与SILVA数据库(http://www. arb-silva.de/)PyNAST算法和RDP Classifier贝叶斯算法对OTU进行分类学分析及Alpha 多样性分析。利用QIIME软件和R语言制作物种丰度表和群落结构图。采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)分析不同样本中细菌群落的整体相似性和差异性。

2.1 桉树-桉树枝瘿姬小蜂-孟氏胯姬小蜂体内细菌高通量测序结果

经过高通量测序，本研究共获得864 135条有效序列，平均长度均大于400 bp，有效率均高于80%，Q20和Q30值均大于90%(表1)。以97 %相似水平对有效序列进行聚类，共获得1 102个OTU，其中南宁桉树枝瘿姬小蜂雌成虫(NLI)、四川桉树枝瘿姬小蜂雌成虫(SLI)、四川孟氏胯姬小蜂成虫(SQM)、桉树枝瘿姬小蜂幼虫(YC)、巨园桉DH201-2叶柄和主脉(ZW)及无羽化孔虫瘿内部组织(ZZ)样本分别有246，238，414，390，736，594个OTU；
其中有96个OTU为ZW、ZZ、YC和NLI样本所共有，说明桉树枝瘿姬小蜂幼虫和成虫体内的细菌与所取食植物和虫瘿组织体内的细菌具有一定程度的相似性，表明桉树枝瘿姬小蜂可能通过取食从寄主植物获取一定的细菌；
有133个OTU为YC(占34.10%)和NLI(占54.07%)样本所共有，表明桉树枝瘿姬小蜂幼虫和成虫体内的细菌具有一定的相似性；
有168个OTU为NLI和SLI样本所共有，说明桉树枝瘿姬小蜂体内共有细菌很多；
有211个OTU为SQM(占50.97%)和SLI(占88.66%)样本所共有，表明桉树枝瘿姬小蜂与其天敌孟氏胯姬小蜂体内细菌具有一定的相似性(图1)。

表1 桉树-桉树枝瘿姬小蜂-孟氏胯姬小蜂6个样本内生细菌高通量测序结果Table 1 Sequencing statistics of 6 samples among eucalyptus,L.invasa and Q.mendeli

2.2 桉树-桉树枝瘿姬小蜂-孟氏胯姬小蜂体内细菌群落组成分析

基于OTU的注释结果可知，桉树-桉树枝瘿姬小蜂-孟氏胯姬小蜂体内细菌多样性差异明显，6个样本(NLI、SLI、SQM、YC、ZW和ZZ)共获得24个门，55个纲，126个目，225个科，497个属的细菌，其中ZW样本体内细菌在各分类水平上获得的个数最多，而SLI样本体内细菌在各分类水平上获得的个数最少(表2)。

表2 桉树-桉树枝瘿姬小蜂-孟氏胯姬小蜂6个样本内生细菌不同分类水平的数量Table 2 Number of species at each classification level of 6 samples among eucalyptus,L.invasa and Q.mendeli

由图2-A可知，在门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)在所有样本中均存在，其中变形菌门(Proteobacteria)是所有样本的优势菌门，在SLI、NLI、YC、SQM样本中相对丰度分别达到了98.22%，95.43%，86.25%，67.77%。在ZW和ZZ样本中，厚壁菌门为次优势菌门，其相对丰度分别达到31.39%和31.05%。在YC样本中，厚壁菌门相对丰度为8.09%。在SQM样本中，厚壁菌门相对丰度为9.29%，拟杆菌门相对丰度为11.10%，放线菌门相对丰度为6.27%。

由图2-B可知，在属水平上，ZW样本体内菌群中优势菌为甲基杆菌属(Methylbacillus)，相对丰度为13.01%，次优势菌为埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)，相对丰度为8.31%；
ZZ样本体内优势菌群为链球菌属(Streptococcus)和拟杆菌属(Bacteroides)，相对丰度分别为7.71%和6.55%。桉树枝瘿姬小蜂的幼虫(YC)、成虫(NLI和SLI)以及天敌孟氏胯姬小蜂(SQM)的优势菌均为立克次氏体属(Rickettsia)，而立克次氏体属在ZW和ZZ样本中相对丰度很低，但在YC、NLI、SLI和SQM样本中的相对丰度分别为81.49%，93.39%，91.92%和39.73%。此外，不动杆菌属(Acinetobacter)是SQM样本中的次优势菌，相对丰度为20.37%。

2.3 桉树-桉树枝瘿姬小蜂-孟氏胯姬小蜂体内细菌群落组成相似性分析

主成分分析结果表明，南宁地区桉树枝瘿姬小蜂幼虫、南宁和四川地区桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内细菌群落结构类似；
巨园桉DH201-2叶脉和叶柄与无羽化孔虫瘿组织距离较近，说明彼此之间的细菌群落组成有一定的相似性(图3)。

聚类分析结果表明，ZW和ZZ聚为一分支，而NLI、SLI、YC和SQM聚在另一分支上，说明桉树枝瘿姬小蜂幼虫、成虫与孟氏胯姬小蜂体内菌群结构和丰度存在一定的相似性(图4)。

本研究结果表明，桉树-桉树枝瘿姬小蜂-孟氏胯姬小蜂三者体内细菌具有一定的相似性。昆虫体内的细菌可以从外界环境中获取，比如翟小战[24]研究发现,中华按蚊(Anophelessinensis)体内细菌主要来自于所生活的水体环境中。此外，通过取食昆虫也可以获得一些微生物，比如棉铃虫体内的大多数细菌与所取食叶片内的细菌具有高度相似性[26-27]。烟粉虱可将体内的沃尔巴克氏体传递给其寄生蜂，而寄生蜂从烟粉虱体内获得的沃尔巴克氏体也可以传递给烟粉虱[28-30]。本研究发现，巨园桉DH201-2、无羽化孔虫瘿组织、桉树枝瘿姬小蜂幼虫和成虫体内细菌共有96个相同的属，同时巨园桉DH201-2和桉树枝瘿姬小蜂成虫体内细菌有133个相同的属，彼此之间具有一定的相似性，推测桉树枝瘿姬小蜂体内细菌可能是通过取食巨园桉DH201-2获得的，但还需进一步试验证明。本研究结果显示，四川和南宁地区的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内细菌有168个相同的属，四川桉树枝瘿姬小蜂和孟氏胯姬小蜂体内细菌共同享有211个属，且这3个样本在UPGMA聚类图上集聚在一个大分支上，由此可推测南宁地区的桉树枝瘿姬小蜂和孟氏胯姬小蜂体内菌群结构组成具有一定的相似性。昆虫体内的细菌还可能通过繁殖垂直传递给下一代。Knorr等[31]报道了红粉甲虫(Triboliumcastaneum)体内的假单胞菌(Pseudomonas)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)等可通过母体垂直传递给子代。Koch等[32]在分析欧洲蜜蜂(Bombusterrestris)体内细菌多样性时发现大多数细菌来自母本体内。Yukuhiro等[33]发现，褐粉虱(Nilaparvatalugens)体内的共生菌与母本卵巢内共生菌相似，说明昆虫体内的细菌还可通过卵巢进行传递。本研究发现，桉树枝瘿姬小蜂幼虫和成虫体内细菌有11个相同的门、96个相同的属，主要菌群组成相对丰度较高并且极为相似，说明桉树枝瘿姬小蜂体内细菌可能是通过母体进行传递的，后续还需通过对其卵、卵巢及各发育阶段进行定量PCR、荧光原位杂交等试验进一步证实。

本研究还发现立克次氏体(Rickettsia)在南宁地区的桉树枝瘿姬小蜂幼虫、成虫和四川地区的桉树枝瘿姬小蜂成虫、孟氏胯姬小蜂体内细菌中相对丰度较高，说明立克次氏体能稳定存在于昆虫体内，并可能是垂直传递的。而其在虫瘿组织体内细菌中仅占3.48%。这可能是由于桉树枝瘿姬小蜂取食时将体内的立克次氏体传递给植物，也可能是幼虫在虫瘿内生长过程中将体内的立克次氏体传递给植物所造成的。不过目前还没有证据表明桉树枝瘿姬小蜂和孟氏胯姬小蜂体内立克次氏体能够进行水平传递，还需要进一步研究[34]。已有研究表明，立克次氏体是一种广泛分布于节肢动物体内的母系遗传共生细菌，能够在亲代和子代之间垂直传递，并调控诸多宿主昆虫的生殖行为，诱导孤雌生殖[35-37]和杀雄等现象[38-39]。立克次氏体主要存在于桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫体内，可能是造成桉树枝瘿姬小蜂孤雌生殖的原因[14-15]。通过饲喂抗生素来消除雌性体内立克次氏体应该可以增加雄性后代的比例，Giorgini等[35]研究发现含有立克次氏体的寄生蜂 (Pnigaliosoemius)仅产生雌虫后代，用质量浓度20 mg/mL的利福平处理24 h消除立克次氏体后，几乎全部为雄性后代。Hagimori等[36]报道了立克次氏体与潜叶蝇类害虫的优势寄生性天敌昆虫芙新姬小蜂(Neochrysocharisformosa)的孤雌生殖有关，四环素处理后出现了大量雄性后代。因此，未来应用抗生素处理去除其体内的立克次氏体，进一步明确立克次氏体是否参与操纵桉树枝瘿姬小蜂繁殖。除此之外，立克次氏体还可以影响宿主的适合度和抵御环境的能力[40-44]。比如对感染立克次氏体和未感染立克次氏体的两个B型烟粉虱(BemisiatabaciB-biotype)种群的生物学特性研究后发现，感染立克次氏体的烟粉虱在卵至成虫的阶段发育速度更快[41]。Himler[42]研究发现，感染立克次氏体还可以提高宿主B 型烟粉虱的产卵量、存活率及后代雌虫的比例，缩短发育历期。

本研究首次详细比较了桉树-桉树枝瘿姬小蜂-孟氏胯姬小蜂内生细菌群落，发现三者体内细菌有密切联系，且具有一定的相似性。该结果有助于了解桉树-桉树枝瘿姬小蜂-天敌昆虫之间的相互作用，进而从共生菌新角度探讨桉树枝瘿姬小蜂入侵与爆发机制，为桉树枝瘿姬小蜂的“共生入侵”假说提供佐证。