乳腺癌疫苗的现状与展望

史福军

南方医科大学珠江医院普通外科中心乳腺外科（广州 510280）

目前临床上化疗、靶向治疗、内分泌治疗三者已经构成了乳腺癌非手术治疗的基石，其总体治愈率也有了显著提高。但是目前的治疗手段对晚期乳腺癌患者的治疗效果不佳。肿瘤疫苗疗法的出现有望解决这个临床难题。本文旨在结合目前乳腺癌疫苗的临床研究结果，对其发展前景进行评述并为开发治疗或者预防效果更好的乳腺癌疫苗提供参考。

乳腺癌是一种起源于乳腺导管上皮的恶性肿瘤。根据国际癌症研究机构（IARC）报道，自2020年以来乳腺癌已经成为全球发病率第一位的癌症。在美国，2022年估计新增乳腺癌病例290 560例，其中女性患者287 850例，占女性新增癌症总数的31%，在女性新增癌症中排第一；
2022年预估乳腺癌死亡病例43 250例，占女性新增癌症相关死亡病例的15%，在女性新增癌症相关死亡病例中排第二，仅次于肺癌[1]。根据雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、Ki67和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）这四种因子的表达水平，乳腺癌可以分为luminal A型、luminal B型、HER2过表达型以及三阴型乳腺癌（TNBC）。HER2受体属于EGFR家族受体，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌和肾癌等多种癌症的发病机制中发挥关键作用。EGFR家族包括4种受体：HER1（EGFR）、HER2、HER3和HER4。有研究发现，HER2受体在大约20%～30%的乳腺癌患者中过度表达。因此，基于HER2的靶向治疗，研究人员开发出了具有抗肿瘤特性的单抗。曲妥珠单抗是FDA批准的第一个推荐用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌的单抗。它通过多种机制发挥抗肿瘤作用，如诱导细胞凋亡、诱导细胞周期停滞、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、抑制HER2胞外区的脱落以及抑制下游信号转导通路等。单抗治疗乳腺癌是一种有效的治疗策略[2]，但它有其自身的缺点，如费用、治疗持续时间和频率、耐药性和耐受性等。此外，一旦肿瘤在治疗过程中发生基因突变，便更加容易转移并产生耐药性[3-4]，从而影响患者预后。

肿瘤疫苗疗法可以利用癌细胞的特异性抗原，使免疫系统长期激活，特别是由于机体存在长时间的免疫记忆，可以降低癌症复发的几率。由于肿瘤疫苗独特的作用机制，其有望解决晚期转移性乳腺癌这一临床治疗难题。另一方面，疫苗不需要频繁接种，而且从历史上看，疫苗比化疗相对安全。在乳腺癌类型中，HER2阳性和三阴型乳腺癌（TNBC）亚型免疫原性最强[5]，对于这些类型的患者，研究人员认为可以通过制备相应的疫苗来激活患者的免疫系统。尽管目前总体进展缓慢，这一领域的临床转化面临挑战，但临床前研究为癌症疫苗提供了强有力的支持。因此，开发适用于临床的乳腺癌疫苗对于乳腺癌的预防和治疗都有重大意义。

多肽疫苗的作用机制主要有：首先，在疫苗注射后相关多肽与抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）的Ⅰ类和Ⅱ类人类白细胞抗原（HLA）结合，形成多肽-HLA复合体；
其次，CD8+T细胞能够识别多肽-HLA复合体并产生特异性细胞毒性淋巴细胞（CTL）；
最后，CTL特异性识别表达抗原的肿瘤细胞，然后释放穿孔素和细胞因子来溶解肿瘤细胞[6]。与其他类型的疫苗相比，多肽疫苗有其独特的优势，如合成容易，可以应用生物信息学等方法来筛选具有肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens，TAAs）的MHCⅠ类限制性多肽表位的候选氨基酸序列，并且可以对这些候选抗原表位进行抗原特异性免疫反应的实验筛选。到目前为止，在乳腺癌多肽疫苗研究中的大多数多肽抗原来源于HER2蛋白和其他HER2衍生多肽[7]。与肿瘤特异性抗原不同，TAAs为在肿瘤和正常组织中普遍表达的自身蛋白，但是它们在肿瘤细胞中异常表达[8]。由于HER2在人正常组织也有表达，因此机体已经对其产生了免疫耐受。但是，由于HER2具有高免疫原性，部分乳腺癌患者仍能对HER2产生免疫反应。除了选择合适的抗原以外，多肽疫苗的效果还与佐剂的选择有关，佐剂的主要作用是确保启动T细胞的APC有足够的共刺激作用[9]。

目前针对HER2的多肽疫苗主要有E75（p369-377）、GP2（p654-662）和AE37（p776-790）。E75是一种来源于HER2受体的9个氨基酸的多肽，氨基酸序列为KIFGSLAFL，它能与HLA-A2结合，从而激活CTL。目前已经有临床研究证实了E75的有效性和安全性[10-11]。在一项涉及187例淋巴结阳性和高危淋巴结阴性（≥T2，3级，HR-，IHC或FISH扩增＞2.0的HER2 3+）乳腺癌患者的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，通过联合使用E75和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）进行了进一步的研究。结果表明使用E75的患者5年无病生存率（DFS）为89.7%，使用安慰剂的患者的5年无病生存率（DFS）为80.2%[12]。随后在一项Ⅲ期临床试验中，使用佐剂GM-CSF与E75对758例HER2低表达（IHC 1+/2+）淋巴结阳性的乳腺癌患者进行了评估，结果表明在观察组和对照组之间DFS没有差异[11]。

GP2是一种来源于HER2（654-662）跨膜区片段的免疫原肽，是一种9个氨基酸的多肽疫苗，其序列为IISAVVGIL，它已被证明能与HLA-A2结合并激活CTL[13]。一项Ⅰ期临床试验表明联合GMCSF的GP2对淋巴结阴性的乳腺癌患者有较好的安全性和耐受性[14]。Ⅱ期临床试验在180例淋巴结阳性和淋巴结阴性乳腺癌患者（HER2 IHC 1+～3+）中进行。该研究表明观察组与对照组的DFS差异无统计学意义，但该研究证实了GP2疫苗的安全性[15]。

AE37是一种由15个氨基酸残基组成的多肽，来源于HER2的细胞内结构域。与E75和GP2不同，AE37主要诱导CD4+T细胞活化[16]。一项Ⅰ期临床试验证明AE37和GM-CSF联合给药的安全性，同时可以成功引发HER-2/neu的特异性免疫应答[17]。在一项涉及到298例淋巴结阳性和高风险淋巴结阴性乳腺癌患者的Ⅱ期临床试验中，对观察组和对照组的处理措施分别为AE37联合GM-CSF以及GM-CSF单独给药[18]。其研究结果表明在总体患者中观察组5年DFS为86.8%，对照组为82.0%，结果差异无统计学意义（P=0.21）。但是在TNBC患者（HER2 IHC 1+/2+、激素受体阴性）中，观察组DFS为77.7%，而对照组为49.0%（P=0.12），这表明AE37疫苗可能对低HER2表达肿瘤患者具有临床疗效。

人端粒酶逆转录酶（hTERT）在人类癌症中几乎普遍存在过表达，对肿瘤发生发展有关键作用[19]。一项研究[20]对19例转移性乳腺癌患者接种了hTERT肽疫苗，其中9例出现hTERT诱导的特异性CD8+T细胞免疫应答，且9例免疫学高应答者的中位OS更长。

与多肽疫苗相比，以完整蛋白（HER2胞内或胞外区域）作为疫苗可以避免特定的HLA限制，因为其同时包含HLAⅠ类和Ⅱ类表位。已有研究证明蛋白质疫苗可以引发特异性免疫。在一项涉及29例HER2过表达乳腺癌或卵巢癌患者的Ⅰ期临床试验中，给患者接种了HER2胞内结构域（ICD）蛋白疫苗（p676-1255）以及GM-CSF[21]。研究结果表明HER-2/neu ICD蛋白疫苗具有良好的耐受性，同时分别有89%和82%的患者可以产生特异性T细胞和抗体免疫。重组HER2蛋白疫苗（dHER2）是由HER2胞外区（ECD）和胞内区（ICD）片段与佐剂AS15结合而成的重组蛋白。

在另外一项Ⅰ期临床试验中，61例未使用过曲妥珠单抗的Ⅱ-Ⅲ期HER2阳性乳腺癌患者在手术切除和辅助治疗后接受了dHER2治疗。结果显示dHER2剂量与dHER2相关的特异性体液免疫的发生率之间存在正相关关系，并且在接受最高dHER2剂量的8例患者中，有6例患者在接种后5年都能保持其dHER2特异性体液免疫[22]。

DNA疫苗是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到体内，使外源基因在活体内表达，其产生的抗原能够激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。一项小型Ⅰ期临床试验对8例转移性HER2+乳腺癌患者接种了编码HER-2/neu的质粒DNA疫苗以及佐剂GM-CSF和IL-2[23]。8例患者中有6例完成了3个周期的疫苗接种，且都接受了曲妥珠单抗治疗。在研究中没有观察到与疫苗接种相关的副作用或毒性。研究结果显示在接种疫苗后没有立即观察到HER2特异性的T细胞免疫应答，但在长期随访中检测到MHCⅡ类限制性T细胞对HER2的反应显著增加。

乳腺珠蛋白-A（mammaglobin-A，Mam-A）是一种分子量10 kDa的分泌蛋白，在80%的原发性和转移性人类乳腺癌中过表达。在一项Ⅰ期临床试验中，15例Mam-A+的乳腺癌患者接种了Mammaglobin-AcDNA疫苗6个月后，在外周血检测到参加研究的前7例患者显示CD4+ICOS（hi）T细胞数量增加，CD4+FoxP3+T细胞数量减少[24]。Mam-A cDNA疫苗的接种与CD4+ICOS（hi）T细胞的特异性扩增和活化有关，并且这些活化的CD4+ICOS（hi）T细胞可以诱导表达Mam-A蛋白的人乳腺癌细胞的优先裂解[25]。

树突细胞（DC）是一种APC，它能够将外源性和内源性抗原分别呈递给CD4+T细胞和CD8+T细胞。目前可以通过从肿瘤患者的外周血中分离得到未活化或未成熟的树突状细胞（immature dendritic cells，imDCs），并向其直接添加TAAs或者编码TAAs的载体转染DC，从而得到携带TAAs的IDCs。接着使用特定的细胞因子刺激使其活化成熟，然后将成熟的树突状细胞注入患者体内，TAAs将被呈递给CD4+/CD8+T细胞，从而启动强大的特异性免疫应答[26]。在一项小型临床研究中，7例Ⅱ-Ⅳ期HER2过表达乳腺癌患者在术后且完成4周辅助治疗后接种了HER2胞内结构域（ICD）刺激的自体DC疫苗。在平均5年的随访后，有6例患者可以检测到抗ICD抗体，且7例患者全部存活[27]。

以上介绍的几种乳腺癌相关多肽疫苗在各项临床研究中都显现出一定的优点，包括可耐受的副作用和安全性、易于合成等优点。但是多肽疫苗本身也有一些局限性。为了确保APC对T细胞的共刺激作用，多肽疫苗需要相应的免疫佐剂才能发挥一定的疗效。同时由于通用型疫苗只能针对有限的几个表位发挥作用，当肿瘤相关抗原发生突变时便容易出现免疫逃逸。此外还有包括半衰期短、体内清除率高等其他缺点[28]。而与多肽疫苗相比，蛋白质疫苗在合成难度、疫苗副作用及安全性、结构稳定性方面没有显著优势。但是在另一方面，蛋白质疫苗可以避免特定的HLA表位限制，同时可显著激活T细胞，提高机体免疫应答水平[29]。前文介绍的乳腺癌DNA疫苗的Ⅰ期临床试验结果虽然表明了相关疫苗可以在受试人体内成功诱导相关免疫应答，但是其安全性和免疫原性还需要进一步研究验证。同时，由于DNA疫苗也是通过不同的TAAs设计的，因此也不可避免要面对TAAs突变后的免疫逃逸问题。并且与其他类型的疫苗相比，DNA疫苗的疗效还受到质粒载体及相关递送系统的影响。而与上面几种类型疫苗相比，使用患者自体血分离生产的DC疫苗的副作用更小。但是，从全血或白细胞中分离单个核细胞、在外周刺激产生成熟的DC细胞等程序也与DC疫苗的疗效相关[30]。

目前由于我国不仅乳腺癌发病率高，还有庞大的人口基数，因此乳腺癌已经给我国的医疗卫生建设事业造成了沉重的负担。因此，目前除了开发治疗性疫苗以外，研发针对乳腺癌的预防性疫苗也同等重要。与治疗性疫苗相比，预防性疫苗的应用人群更广。因此，考虑到成本控制，生产工序、安全性等问题，多肽疫苗适用于开发预防性疫苗。同时针对因TAAs突变而造成免疫逃逸的问题，目前可以考虑选择覆盖多种肿瘤相关抗原，或者选择相对稳定不易突变的TAAs作为靶点。另外，由于蛋白质疫苗可以避免特定的HLA表位限制，因此其也适合用于开发预防性疫苗。由于治疗性疫苗需要保证其临床疗效，因此，在开发通用型治疗疫苗的过程中，上述几种疫苗同样可以选择复数或者不易突变的TAAs。此外，为了追求更好的治疗效果，也可以针对每个患者制作个体化新抗原疫苗。通过生物信息技术，从来源于患者的病理标本中筛选出免疫原性强、诱导生成的CTL杀伤力强的多个特异性表位，并将其制作成相应的个体化新抗原疫苗。同时，也可以尝试将疫苗疗法与现有的化疗、内分泌治疗、靶向治疗等手段相结合。

与化疗、激素治疗、被动免疫治疗、放疗等方式相比，乳腺癌疫苗具有以下理论优势：耐受性较好、毒性更低、给药时间短以及可以产生特异性抗肿瘤作用的持久免疫反应。但是，乳腺癌相关疫苗也有其自身的局限性：（1）由于大多数疫苗为MCH-Ⅱ类限制，这可能使能从接种乳腺癌相关疫苗获益的患者人群减少；
（2）多数疫苗需要和佐剂联合应用才可取得一定的疗效，因此可以通过开发更有效的佐剂、改变疫苗剂型等方式来尝试提高疫苗疗效；
（3）上述疫苗针对的是一个或少数几个通用表位，这可能无法克服肿瘤的免疫逃逸机制，导致疫苗的疗效降低，研究表明在肿瘤免疫微环境中CTL识别TAAs并破坏肿瘤细胞这一过程会受到抑制[31]。近年还有报道其他机制参与免疫抑制，包括髓系抑制细胞（MDSCs）的扩增[32]、机体代谢变化[33]、树突状细胞（DC）的抑制[34]等。因此，针对这一点，可以通过选择更具特异性且稳定不突变的TAAs以及增加通用表位数量来提高疫苗的疗效。另外，随着测序技术的进步，通过全外显子测序以及RNA测序来识别个体化新抗原并制作的新抗原疫苗已经针对黑色素瘤取得了良好的长期疗效[35]。因此，为了减少免疫逃逸，可以通过针对乳腺癌患者的特异性新抗原制作个体化新抗原疫苗。同时除了上述几点以外，还可以通过优化疫苗成分、更改给药方式、选择加强接种加强针等方式来尝试改善疫苗疗效，也可以探索疫苗疗法与手术、放疗、化疗、内分泌治疗和单抗等其他治疗方法结合后的治疗效果。