mTOR、PTEN、Ki-67,蛋白表达水平变化与结肠癌病理学特征的相关性分析

张秀娟，黄丽娟

（新疆生产建设兵团第二师库尔勒医院病理科，新疆 库尔勒 841000）

结肠癌（colon cancer）的病情进展导致患者整体生存预后的恶化，加剧患者无瘤生存时间和无进展生存时间的缩短[1，2]。肿瘤相关蛋白的表达改变能够促进癌细胞在增殖、凋亡、分化等病理过程中的作用，影响癌细胞的生物学特征。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Ki-67 蛋白表达浓度改变，能够提高癌细胞DNA 核的持续性扩增的风险，导致癌细胞上游转录活性的增加，影响纺锤体的形成及分裂，提高染色体复制及扩增的速度[3，4]；
张力蛋白同源蛋白（PTEN）是重要的细胞周期调控蛋白，其能够在稳定癌细胞增殖速度的同时，抑制癌细胞持续性浸润风险的增加[5]。部分研究揭示了mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白在卵巢癌、甲状腺癌等恶性肿瘤中的异常表达，认为异常表达的相关指标是促进恶性肿瘤患者临床分期进展、导致治疗预后恶化的重要因素[6]，但关于mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白与结肠癌的临床病理特征的关系研究不足。本研究选取90 例结肠癌组织标本，探讨了相关指标的改变与结肠癌组织病理特征的关系，现报道如下。

1.1 一般资料 收集2013 年3 月-2016 年6 月新疆生产建设兵团第二师库尔勒医院病理科90 例结肠癌组织标本（结肠癌组），45 例正常结肠组织（对照组）。结肠癌组男48 例，女42 例；
年龄44～78 岁，平均年龄（57.72±13.21）岁；
TNM 分期：Ⅰ期17 例，Ⅱ期24 例，Ⅲ期33 例，Ⅳ期16 例；
发生淋巴结转移40 例，分化程度：高分化20 例，中分化37 例，低分化33 例。对照组男25 例，女20 例；
年龄40～73 岁，平均年龄（58.44±12.28）岁。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入排除标准

1.2.1 纳入标准 ①结肠癌的诊断参考《外科学》第八版中的标准[7]；
②结肠癌标本、正常结肠组织来源于我院病理科收集且经病理学检查证实的标本；
③患者年龄≤79 岁；
④既往无放化疗病史；
⑤病案资料及相关检查资料完整。

1.2.2 排除标准 ①转移性结肠癌；
②合并其他部位肿瘤的患者；
③资料不完整，难以纳入统计学分析。

1.3 方法 石蜡包埋，连续性切片厚度3 μm，60 ℃烤片60 min，常规脱水后，采用EDTA 进行抗原修复，加入10 μl 蒸馏水，加入10%过氧化氢5 il，室温下孵育30 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次×3 min，加入mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白的单克隆抗体（1∶1000 购自罗氏检测公司），37 ℃孵育60 min，PBS洗涤3 次×3 min，加入HRP 标记的mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白二抗（1∶2000 购自罗氏公司），37 ℃孵育20 min，PBS 洗涤3 次×3 min，加入DAB 后，PBS 冲洗和复染，脱水后在显微镜下进行观察[8]。免疫组化结果判定[9]：mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白的阳性着色表达于细胞质、细胞核，阳性染色为黄色或者更深。评分标准：①依据染色深浅：无色（0 分）、淡黄色（1分）、染色为棕黄色（2 分）、如果染色为褐色或者黑色（3 分）；
②依据阳性细胞占比[10]：占比≤10%（1分）、占比11%～50%（2 分）、占比51%～75%（3 分）、占比＞75%（4 分）。染色深浅评分与阳性细胞占比评分之乘积总分＜3 分为阴性、≥3 分为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0 进行数据分析，计量资料使用（）表示，比较采用t检验；
计数资料使用（n）和（%）表示，比较采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2.1 mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白在结肠癌、正常结肠组织中的表达程度比较 结肠癌组mTOR 蛋白、Ki-67蛋白阳性表达率高于对照组，结肠癌组PTEN 蛋白阳性表达率低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白在结肠癌、正常结肠组织中的表达程度比较[n（%）]

2.2 mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白表达与结肠癌组织病理特征的关系 不同TNM 分期、是否发生淋巴结转移、不同肿瘤分化的结肠癌组织中mTOR 蛋白、PTEN 蛋白、Ki-67 蛋白阳性表达率分别比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白表达与结肠癌患者病理特征的关系（n，%）

结肠癌的早期诊断水平较低，治疗后的总体病情缓解率不高[11]。长期的临床随访研究显示，结肠癌的5 年生存率不足35%，手术治疗或者联合放化疗等措施治疗后的中位生存时间不足48 个月[12]。但迄今为止临床上对于结肠癌患者的临床预后及疾病早期诊断缺乏可靠的指标，影像学检查能够在诊断结肠癌过程中发挥重要的辅助价值，但其诊断的早期灵敏度较低，对于微小病变恶性肿瘤的发生风险的评估价值不足[13，14]。研究显示[15]，血清学肿瘤相关指标的检测，具有一定筛查价值，且对于特定类型恶性肿瘤的诊断具有重要的提示作用，能够提高恶性肿瘤早期病变的诊断水平，并能够在疾病的治疗后动态随访等方面发挥作用。

本研究结果显示，结肠癌组mTOR 蛋白、Ki-67蛋白阳性表达率高于对照组，结肠癌组PTEN 蛋白阳性表达率低于对照组（P＜0.05），表明mTOR 蛋白、Ki-67 蛋白、PTEN 蛋白在结肠癌组织及正常组织中的表达水平有明显差异，可在结肠癌筛查中提供一定参考。分析原因为mTOR 对于局部环境中缺氧环境下线粒体的损伤、ATP 能量利用障碍，或者氧化自由基的传递障碍等过程均可发挥一定的作用；
并且能够影响肿瘤细胞DNA 的扩增速度，促进癌细胞核异型性增加，影响癌细胞内多种信号通路如MAPK 激活[16]。Ki-67 蛋白不仅影响恶性肿瘤癌细胞的增殖速度，同时能够干预肿瘤上皮病灶组织的上皮间质转化，促进癌细胞远期器官的转移。PTEN 的表达浓度的变化，能够调控癌细胞的分化，促进癌细胞的分化成熟，调控癌细胞G1/S 周期比例，抑制肿瘤病情的进展[17，18]。mTOR 作为AKT 信号通路的下游效应蛋白，其表达浓度的上升能够显著提高AKT或者MAPK 等信号通路的激活，增加癌细胞的转录风险。PTEN 蛋白的异常表达能够影响癌细胞凋亡速度，抑制癌细胞凋亡，提高癌细胞分增殖能力。Ki-67 蛋白上升能提高癌基因上游启动子激活程度，促进癌基因的持续性扩增[19]。孙红兰等[20]探讨了相关细胞因子的表达与中晚期结肠癌患者的病情关系，患者的病情越为严重、治疗预后越差、病死率越高，mTOR 蛋白的表达阳性率越高。本研究发现，在结肠癌患者病灶组织中，mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白表达波动较为明显，结肠癌组mTOR 蛋白、Ki-67 蛋白阳性表达率高于对照组，结肠癌组PTEN 蛋白阳性表达率低于对照组（P＜0.05），表明mTOR 蛋白、Ki-67 蛋白、PTEN 蛋白在结肠癌组织及正常组织中的表达水平有明显差异，这些指标均可能参与到了结肠癌的病情进展。mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白的异常表达能够导致癌细胞侵袭能力的改变、提高癌细胞对于淋巴结的粘附能力，影响结肠癌患者病情的进展。此外，不同TNM 分期、是否发生淋巴结转移、不同肿瘤分化的结肠癌组织中mTOR 蛋白、PTEN 蛋白、Ki-67 蛋白阳性表达率分别比较，差异有统计学意义（P＜0.05），这可能与mTOR 蛋白的表达异常对于癌细胞浸润能力的增强作用有关，同时还提高了淋巴结内皮粘附分子adherin 的表达。PTEN 蛋白的异常表达对于结肠癌患者临床病理特征的影响，主要在于其对于癌细胞上皮间质转换过程的影响，并调控了癌细胞周期等有关。但本次研究并未发现Ki-67 蛋白的表达与结肠癌患者临床分期的关系，提示Ki-67 对于肿瘤的后期进展可能并无显著的影响。

综上所述，mTOR 蛋白与结肠癌患者的临床分期、淋巴结转移及癌细胞分化有关，PTEN 蛋白与结肠癌患者TNM 分期、肿瘤分化程度有关，Ki-67 蛋白表达与肿瘤分化程度、是否发生淋巴结转移有关，可依此对肿瘤的筛查及预后判断提供参考。