创伤性股骨头坏死动物模型的研究进展

王 岩，马剑雄，董本超，田爱现，李 岩，孙 磊，靳洪震，卢 斌，王 颖，柏豪豪，马信龙

股骨头坏死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）一直是骨科学领域一个复杂又很难治愈的常见疑难疾病，该疾病发病原因多样，发病机制较为复杂[1]。因此，这也导致在临床上处理该疾病时的不确定因素增加。同时，ONFH的初期发病较为隐匿，很难确切诊断，临床中一旦发现往往已经进展到中后期，常常因为干预不及时而面临进行手术治疗的风险。相关流行病学调查显示，ONFH发病率逐年攀升，当前全球已有约一千万人被该疾病所困扰[2]。根据发病因素可将ONFH分为创伤性和非创伤性两大类，随着社会的发展和进步，创伤性股骨头坏死(traumatic-induced osteonecrosis of femoral head，TIONFH)的发病率也在逐年攀升。前些年，大量研究都针对于非创伤性股骨头坏死进行探索。股骨颈骨折一般常发生在老年人群跌倒等外伤以后，老年人是TIONFH的高危人群，在非老年人中是一种少见的损伤，常由高能量的外界创伤引起[3]。据估计，随着世界范围内老龄化人群的增加，到2050年，全世界髋部骨折的数量将从1990年的166万例增加到626万例，届时将会给医疗卫生行业带来越来越大的负担[4]。由于老年人群身体机能减退、常伴随骨质疏松症和肌肉减少症，出现老年髋部骨折后再进行手术的预后不是十分理想，从临床实际情况来看，老年髋部骨折的预防和治疗也是当前骨科疾病领域亟待解决的问题。TIONFH是由髋关节脱位、股骨颈骨折等髋部创伤引起的最常见的无菌性ONFH，是股骨颈骨折的主要并发症[5]。近年来，国内外大量学者也开始重视对TIONFH的发病机制和诊疗手段的研究。研究该疾病的首要任务是需要建立一种理想可靠的动物模型来模拟临床中TIONFH的发病机制及临床表现。虽然目前关于TIONFH的动物模型建模方式有很多，但是仍然没有找到一种理想的动物模型建模方法来贴切地模拟临床中不同病因引起的TIONFH，如若在选择动物模型时出现偏差将会导致该疾病的下一步研究严重受阻。因此，本文归纳总结了当前关于TIONFH动物模型的一些常用建模方法，并分析对比他们的优缺点和适用性，为今后TIONFH的相关研究提供动物模型的基础，助力在TIONFH领域早日实现新的突破。

实验动物的选择是动物模型建模的关键首要步骤，也是医学研究中必不可少的一环，用于建立TIONFH动物模型的实验动物主要分为四足动物和双足动物两大类。四足动物最为常用，包括小鼠、大鼠、兔子、犬、羊等，其中小鼠和大鼠易于饲养、价格便宜且抗病能力较强，但用于研究的目标组织样本较少，不利于后期的结果检测[6]；
兔子属于中小型实验动物，其特点是价格便宜、易于获取，但其抗病能力与大小鼠相比较差，在造模过程中死亡率远高于大鼠[7]；
犬和羊等大型动物的优点在于髋关节和股骨头较大，易于进行手术造模操作，但缺点是费用较高、对饲养环境要求较高。总的来说四足动物更常见且更容易获取，但在模拟TIONFH的疾病进程中，由于其四足行走的方式与人类双足负重具有较大差异，因此不容易形成TIONFH后期的坏死塌陷等表现，不宜用于对该疾病后期的相关研究。双足动物与四足动物相比最大的优点就是双下肢负重的方式与人类相似，髋关节周围的生物力学环境更接近于人类，因此更易于模拟该疾病后期的表现，更适用于进行TIONFH塌陷后的相关研究[8]。常用的双足动物有鸸鹋和猿猴等，但双足动物一般都不易于获取且价格昂贵，这也就限制了其在TIONFH动物模型方面的应用。

TIONFH的主要诱因为髋关节附近由于车祸、跌倒等外界创伤因素引起股骨头周围血供受到破坏导致股骨头内骨小梁组织和骨细胞等缺血，进而出现股骨头的坏死和进一步塌陷。因此阻断股骨头周围的血液供应是建立TIONFH动物模型的的一类经典方法。此方法适用于模拟临床中由于外界创伤因素所形成的TIONFH。

2.1 切断圆韧带并结扎股骨颈法 切断圆韧带并结扎股骨颈法具体造模方法为将实验动物俯卧位固定，随后在大转子上的皮肤上做一个纵向切口，将实验动物的臀大肌和臀中肌分离开来，横切髋关节囊，将股骨头脱位，切断圆韧带并将股骨头基底部股骨颈周围进行血管的阻断，可以用缝合线进行结扎，也可以用电凝装置进行阻断股骨颈周围血管，完成以后将股骨头复位并分层缝合肌肉和皮肤。其中，单独运用切断圆韧带或结扎股骨颈周围血运的方法也能够建立TIONFH动物模型，但那样将会增加造模的周期，降低效率，但死亡率会大幅降低，但如将以上两种方法并用可以缩短建模周期，提高成模效率，更适用于需要快速建立大量模型时使用。此方法的缺点是对动物造成的创伤较大，病情进展较快，不利于进行病情进展的相关研究和观察。Liu等[9]采用3月龄SD大鼠通过切除圆韧带并用缝合线结扎股骨颈的方法成功建立了TIONFH动物模型，建模5周后相关评价结果显示模型组大鼠股骨头大体外观表面呈“蛀蚀”状，组织形态学结果显示股骨头出现坏死表现且破骨细胞活性增强。Cheng等[10]对大鼠左髋进行手术，采用前髋关节切开术，在不移除肌肉的情况下打开囊膜，横切髋圆韧带，随后用电凝法去除股骨颈周围血管，诱导TIONFH，8周后行Micro-CT扫描和定量计算，结果显示模型组大鼠股骨头出现明显的空洞，骨小梁被异常组织替代，出现TIONFH的表现。Deng等[11]采用16只6～8周龄左右的约克郡公仔猪，横切圆韧带后，将缝合结扎紧绕股骨颈，通过手术诱导股骨头缺血性骨坏死。在建模手术后2 d、2周和4周分别进行了大体观察、影像学和组织学评估分析，结果显示4周后股骨头外观出现变形，病理学观察到更多的空骨陷窝，而骨髓间隙显示小血管、坏死头部周围的成纤维细胞和脂肪细胞浸润，破骨细胞活性增强以吸收坏死骨组织。

2.2 栓塞法 采用栓塞法建立TIONFH动物模型是通过阻断和妨碍股骨头周围血供来建模的方法，近些年来开始被大家了解和使用。主要方法是通过注射栓塞剂造成股骨头周围血液循环障碍，最终形成TIONFH。该方法造模的发病机制清楚，动物造模后成活率高，成模率高，而且能够比较完整地模拟人类ONFH的病理过程。此方法的难点在于手术难度大，需要采用大型动物来进行建模，而且目前对于栓塞剂的研发并没有取得理想的结果，因此对栓塞剂的选择是该模型建模的关键点和困难点。马坤等[12]于9只犬的股骨头供血分支动脉主干内导入栓塞剂（平阳霉素和明胶海绵颗粒混合物），栓塞剂注入成功后造影检查显示各分支动脉出现闭塞。于造模后的第2、4、6周分别处死各组犬1只进行相关检测，术后4周的核磁共振检查发现出现TIONFH的早期症状，组织形态学发现出现部分骨小梁断裂情况，6周时症状加重。除此之外还有很多类型的栓塞剂，但是尚无十分理想的栓塞剂供建立激素性ONFH（SONFH）使用，同时介入手术操作复杂这些都限制了此方法的广泛运用。

TIONFH的直接因素是外界因素对髋关节造成创伤后出现股骨颈骨折，随之股骨头周围血供和生物力学环境均出现异常，最终导致TIONFH的发生。因此，大多数TIONFH患者会有股骨颈骨折或髋关节外伤的既往病史。骨折复位模型主要用于模拟临床中由于股骨颈骨折复位不良引起的TIONFH。具体造模方法为在股骨头脱位或半脱位的情况下，用摆锯造成股骨颈完全骨折。随后重新解剖复位后再用内固定物沿大粗隆下股外侧皮质向股骨头中心点行内固定，或手动复位后直接缝合。Zhang等[13]用32只新西兰大白兔进行造模，无菌条件下于右侧髋关节的后外侧行5 cm切口，切开关节囊，露出股骨头。然后用不锈钢骨槽刀在股骨颈形成外力骨折，使股骨头脱位，骨折分离2～3 min。随后重新定位股骨头并用缝线固定，不进行任何固定。造模2周后行结果检测，股骨近端横截面显示模型侧股骨呈白色，表现为缺血性坏死；
核磁共振检查结果显示出现“新月征”；
组织形态学结果显示骨小梁出现断裂，骨小梁组织的空骨陷窝数量增多，出现骨坏死表现。

破坏性模型主要是指对股骨头内部骨组织或细胞进行破坏，造成股骨头内微循环障碍最终形成TIONFH。主要通过向股骨头内部或表面注射对骨组织或细胞能产生破坏性的药物。此类方法虽然与临床实际发病机制不是非常相似，但能够在短时间内快速大量建立TIONFH动物模型，且可重复性好，适用于需要大量动物模型进行治疗及预后方面的研究，不适用于针对发病机制方面的研究。

4.1 液氮冷冻法 液氮冷冻主要是通过在无菌条件下对实验动物髋关节行外侧切口，剥离软组织，打开关节囊并使股骨头脱位，常规方法通过股骨头上端用纱布蘸液氮冷冻，然后用温盐水重新恢复室温，改良方法为采用特定装置将液氮注入股骨头内造成TIONFH，最后复位股骨头后逐层缝合切口。Liao等[14]采用80只新西兰成年家兔进行实验，采用常规液氮冷冻法建立模型后2、4、6、8、10、12周进行取材观察，建模后第4周开始出现股骨头表面异常等骨坏死表现。Wang等[15]采用改良液氮冷冻法对16只小尾寒羊进行造模，首先分离皮肤、筋膜和肌肉层，显露股骨头颈接点，从股骨头颈连接处下内侧向股骨头中心方向钻出直径2 mm、深度10 mm的孔，用低温液氮冷冻仪将液氮注入股骨头内冷冻6 min，然后用温盐水解冻6 min，反复进行3次冻融循环，每只动物用450 mL液氮。分别在造模后1、3、6个月进行影像学检查并行组织学评估，结果显示各时间节点均有不同程度坏死表现；
造模后1个月的组织学评估显示，坏死改变占主导地位，骨小梁组织的空骨陷窝数量增多，造血细胞的数量出现下降的趋势，成纤维细胞数量明显变多。造模后3个月和6个月时，骨折小梁、成纤维细胞和新毛细血管增加，表明骨吸收和骨修复过程同时进行。

4.2 微波加热法 微波加热法与液氮冷冻法建模方法类似，主要是通过对股骨头内部进行微波加热破坏股骨头内部组织结构来建立TIONFH动物模型。Li等[16]采用新西兰大白兔48只分为3组进行造模，Ⅰ组(50 ℃加热10 min)、Ⅱ组(55 ℃加热10 min)和Ⅲ组(60 ℃加热10 min)，具体造模方法为在无菌条件下，从股骨头下钻孔至股骨头中心，径迹直径为1.5 mm，深度为软骨下8 mm，通过钻孔轨道将微波天线置入股骨头中心，对3组进行加热。分别在2、4、6、8、10和12周进行X线检查，发现股骨头有囊性改变和塌陷。

4.3 化学灭活法 化学灭活法主要是通过向实验动物股骨头内注入化学试剂对股骨头内部组织和细胞造成灭火，从而形成TIONFH。该方法造模成模时间短、成功率高，操作简便，重复性高，缺点则是会在股骨头内残留一些化学物质影响实验结果，而且同液氮冷冻法建模类似，由于不符合临床TIONFH疾病的发病过程，因此只能用于TIONFH治疗和预后方面的相关研究，不能用于发病机制相关的研究。该方法所用的化学试剂最常用的就是无水乙醇。陈东等[17]采用新西兰大耳白兔于股骨大转子外侧切口剥离筋膜和周围包括的肌肉、韧带等软组织，随后用穿骨针钻一个直径为3 mm的孔道直通股骨头中心，利用骨穿针套管将无水乙醇1 mL(注射速度为0.1 mL/min)缓缓注入股骨头内。大体观察、影像学及组织形态学结果均显示在第6周出现较为明显的骨坏死表现，提示造模成功。范猛等[18]采用成年鸸鹋20只建模，通过提前定制好的注射探针插入股骨头的附中区域，采用局部缓慢注射8 mL无水乙醇的方式造成TIONFH，并于造模后每隔2周进行髋关节的磁共振检查，实验结果显示直至12周在影像学与组织形态学均显示出明显的TIONFH表现，建模后24周观察股骨头已出现恢复趋势。

随着社会的发展和进步，TIONFH的发病率逐年上升，大多数疾病高发于一些外界高能量创伤股骨颈骨折术后几年内，将对患者的生存质量造成深远的影响，给社会和经济带来严重的负担。通过建立理想的动物模型能够贴切模拟临床TIONFH的发病过程，从而为该疾病的病因、机制及诊疗方法的研究提供基础。当前关于TIONFH的动物模型研究十分广泛，最常见的是血供受阻模型，该方法主要模拟临床中由于外伤引起的股骨头周围血供障碍导致的TIONFH；
其次是骨折复位模型，该类模型主要从术后复位不良生物力学环境改变的角度模拟临床中一些患者出现股骨颈骨折后复位不良造成的TIONFH；
而破坏性模型的发病机制与临床中该疾病相差甚远，因此主要用于该疾病诊疗于预后的相关研究。虽然目前关于TIONFH的动物模型有很多类型，但是在开展相关研究前要根据研究目的来选择对应合适且能够准确模拟临床现象的模型，借助动物模型在该疾病相关领域的研究中实现新的突破，造福患者。