慢性疲劳综合征大鼠模型的行为学特征研究

徐小珊，田岳凤，翟春涛，李 玮

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)作为亚健康的一种重要表现形式，以不明原因的持续性疲劳(>6个月)为其主要临床表现，并伴有多种其他系统症状如肌肉酸痛、食欲减退、睡眠障碍等，已成为困扰人类健康的主要问题之一，易发展为多种疾病的前期状态，甚至进一步危害认知功能与精神状态[1-2]。随着时代的飞速发展与物质生活的极大丰富，该病发病率逐年增加，给人们的生产水平、生活质量都带来了很大的负面影响[3-4]。调查结果表明，CFS总体患病率约为0.89%，女性患病率较高于男性，各年龄层与职业人群均出现不同程度的疲劳症候群，但具体数值随诊断方法与疾病定义波动明显[5-6]。

CFS现已成为21世纪临床研究的热点，其发病机制尚未清楚，认为其与多系统功能异常相关，通过基因表达、能量代谢及免疫系统等方面研究来解释CFS病人的临床表现，尚无明确定论[7-9]。因此，构建动物模型来研究CFS发病机制对于临床上更深入地认识并治疗CFS有着非常重要的意义。

目前，国内外研究者主要选择单一刺激或复合刺激等多种手段，通过强制力竭游泳、跑台训练等体力消耗性方法进行身体疲劳造模，采用慢性束缚、剥夺睡眠、不定时禁食等手段造成心理疲劳[10-11]，能够兼顾躯体与心理两方面的压力，更好地模拟CFS致病因素与发病过程，但造模方法尚未规范统一。本实验参考文献[12-13]选择力竭游泳与慢性束缚两种干预措施进行复合造模，造模期间观察大鼠一般状态、摄食量、体质量变化情况，并选择旷场试验与悬尾试验作为标准，配合血清学与组织形态学指标，来观察各组大鼠造模进程中CFS疾病形成过程，检测造模成功与否，并作为进行下一步实验的主要凭证。大量文献显示，CFS多选择每日束缚加力竭游泳的多因素造模方法，造模时间为14 d[14-15]。但课题组参照文献实验方案在造模过程中发现，造模14 d后，采用旷场实验与悬尾实验[16-17]证实模型尚未完全成功。因此，在进行实验过程中，按照文献造模方法并加以改进，相对来说排除了如大鼠应激反应强烈等干扰因素，减少了不必要的实验误差，并可以进一步明确模型成功的标准，使实验操作过程更规范，更贴合实验具体情况，为后续行为学检测提供了较易复制的实验过程。现报道如下。

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与饲养条件 无特定病原体(SPF)级SD大鼠30只，雌雄各半，体质量(200±20)g。实验动物及饲料均由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。根据随机数字表法将实验动物分为空白组与模型组，每组15只。实验期间温度控制在20～25 ℃，湿度控制在30%～50%，鼠笼与水壶定时清洗并消毒，垫料及时更换，保证环境清洁与空气流通。

1.1.2 主要仪器 电子天平：精度0.1 g，永康市永州衡器有限公司(产品型号：SF-400)；
自制束缚筒：管状自制塑料筒，长约20 cm，外直径约6 cm，筒前段开一小直径通气口(直径约3 cm)，后端为直接可开关闸门让大鼠进入，大鼠头向通气口进入后关闭闸门，调整瓶身直径为老鼠不能转向且不过分压迫的大小；
自制大鼠PVC游泳箱，约为60 cm×50 cm×40 cm大小；
悬尾测定仪：自制塑料悬挂鼠尾板，安徽正华生物仪器设备有限公司(ZH-YLS-181)；
旷场实验仪器：成都泰盟软件有限公司(OFT大小鼠开场活动实验系统)；
酶标仪：上海永创医疗器械有限公司(型号：SM600)；
生物显微镜：日本Olympus公司。

1.2 造模方法 将30只SPF级SD大鼠随机分为空白组与模型组，对模型组进行造模，上午采用力竭游泳，下午慢性束缚，共造模21 d。力竭游泳造模方法：使大鼠在自制游泳箱(长60 cm，宽50 cm，高40 cm，水深30 cm)内进行强制游泳，采用强迫手段使大鼠在水面上维持持续游泳状态，静止时长不能超过5 s。以大鼠游泳动作明显失调，或头部沉入水中10 s不能浮出水面为力竭标准。慢性束缚方法：将大鼠置于自制束缚筒内(筒长20 cm，内径5.3 cm，外径6.0 cm)，使其处于不产生强烈反抗的紧张程度，头向通气孔方向，注意观察并记录大鼠束缚状态，每次束缚3 h。

1.3 观察指标

1.3.1 一般状态观察 造模期间，每日观察大鼠的体型、毛色、活动情况、精神状态以及每日饮水情况等一般状态，同时对大鼠每日摄食量进行测定，记录变化。

1.3.2 体质量的测定 每日进行体质量测定，比较造模过程中1 d、7 d、14 d、21 d两组体质量差异。

1.3.3 旷场实验情况变化 旷场实验主要用于评价在陌生环境中实验动物的自主探究行为以及紧张程度等情绪反应，是在判断CFS模型建立成功与否时对心理疲劳状态观察的一项重要行为学指标。将大鼠放入旷场实验箱的正中格内，观察大鼠在一段时间内的活动情况。测定指标：①水平跨格数(3爪以上跨入临格的次数)；
②站立次数(两前肢完全离地并保持直立的次数)；
③运动距离(在各格间运动的距离总和)。在造模前后进行旷场实验并进行组间比较。

1.3.4 悬尾实验情况变化 悬尾实验主要用于反映造模后大鼠体力变化情况以及疲劳程度，能通过大鼠挣扎次数来充分体现大鼠体力下降水平，以及大鼠愤怒情绪下试图改变不适状况的强烈愿望，不动时间则显示出了大鼠因无可回避的压迫环境产生的“行为绝望状态”，与抑郁疾病表现相似，属于判断大鼠心理与身体双重疲劳的一项有效行为学指标。于造模各节点进行悬尾实验并比较两组间差异。

1.3.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清免疫球蛋白及血乳酸变化 造模结束后对大鼠进行腹主动脉取血，置于含促凝剂的真空管中，静置10 min后，以3 000 r/min离心，取上清液，采用ELISA检测两组大鼠血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、补体C3以及血乳酸的含量。

1.3.6 苏木精-伊红(HE)染色观察股四头肌组织形态变化 造模结束后取大鼠双侧股四头肌组织，生理盐水清洗后吸干表面水分，后置于4%多聚甲醛溶液中固定，进行HE染色，观察两组大鼠股四头肌组织形态学差异。

2.1 一般情况 造模后大鼠出现饮水量减少以及不同程度的摄食量下降趋势，但与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠毛发稀疏、光泽减退、体型明显减小，出现烦躁多动的表现，眯眼明显，精神较萎靡，喜欢扎堆。同时部分大鼠出现嗜睡、大便稀、逃避反应能力明显降低，出现好斗倾向，部分大鼠存在不同程度的耳部、尾部并下肢受伤，部分伤情明显。详见图1。

图1 两组大鼠摄食量变化情况

2.2 两组体质量变化 两组造模前(1 d)体质量与造模后7d较1d的体质量增加值差异无统计学意义(P>0.05)；
模型组造模后14 d、21 d较1 d的体质量增加值低于空白组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图2。

表1 两组体质量变化比较(±s) 单位：g

与空白组比较，＊P<0.05。图2两组大鼠体质量增加情况(以1 d为基数计算体质量增加值)

2.3 旷场实验 造模14 d，与空白组比较，模型组水平跨格数与站立次数虽均有所下降，但差异均无统计学意义(P>0.05)。造模21 d，模型组水平跨格数与站立次数较空白组均明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组造模14 d和21 d运动距离与空白组比较有下降趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图3～图5。

与空白组比较，＊P<0.05。图3两组大鼠造模14 d、21 d水平跨格数比较

与空白组比较，＊P<0.05。图4两组大鼠造模14 d、21 d站立次数比较

与空白组比较，＊P<0.05。图5两组大鼠造模14 d、21 d运动距离比较

2.4 悬尾实验 造模14 d，与空白组比较，模型组挣扎次数减少，不动时间变长，但差异无统计学意义(P>0.05)。造模21 d，模型组悬尾实验挣扎次数较空白组明显减少，不动时间较空白组明显变长，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图6、图7。

与空白组比较，＊P<0.05。图6两组大鼠造模14 d、21 d挣扎次数比较

与空白组比较，＊P<0.05。图7两组大鼠造模14 d、21 d不动时间比较

2.5 血清中IgA、IgG、补体C3及血乳酸水平变化 与空白组比较，模型组血清中IgA、IgG、补体C3水平明显降低(P<0.05)，血乳酸水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图8。

与空白组比较，＊P<0.05。图8两组IgA、IgG、补体C3及血乳酸水平比较(A为两组IgA水平比较；
B为两组IgG水平比较；
C为两组补体C3水平比较；
D为两组血乳酸水平比较)

2.6 大鼠股四头肌组织形态学变化 经HE染色后镜下观察，空白组股四头肌肌纤维轮廓清晰，多呈长圆柱状，细胞核呈扁圆形或椭圆形，胞膜完整，肌节清晰可见。模型组较空白组细胞间隙小，部分肌纤维胞质染色不均，胞核固缩、凝聚，部分可见炎症细胞浸润。详见图9。

图9 两组大鼠股四头肌组织形态学变化(×200)

3.1 造模过程优化 起初按照文献[18]选择造模方法，隔日进行力竭游泳与慢性束缚实验，总造模时长为14 d，并于造模结束后进行行为学观察，发现各项行为学指标与空白组比较均不明显，提示此时模型尚未完全成熟。后对造模方法进行了改进与优化，将造模计划更改为21 d持续疲劳造模，同时将隔日交替实验改为每日上午力竭游泳，下午慢性束缚，造模结束后发现模型大鼠状态符合成模标准。

3.2 行为学检测手段优化

3.2.1 悬尾实验优化过程 首先，对于鼠尾悬挂实验的仪器经过改良。参考文献[19]实验，起初选择自制鼠尾悬挂板，中央制作一个直径约1 cm孔洞，将距大鼠尾端约2 cm部位穿过圆孔并固定，使大鼠呈倒挂姿势离地面约1 m。经初次实验后发现该种方法得到的实验结果存在明显差异，塑料板的可视性引起大鼠恐慌情绪，大鼠固定位置偏下难以使大鼠完全固定等，都会对实验结果存在一定干扰。为此，使用悬尾测定仪进行观察，将距大鼠尾端1 cm部分固定于仪器挂钩上，两侧有木板阻挡大鼠视线，同时保持环境相对安静，减少对大鼠的额外刺激，发现实验结果改善明显，最后选择悬尾测定仪作为观察仪器。其次，对大鼠悬尾实验测定时间也进行调整，起初通过查阅文献，选择计算5 min内大鼠的挣扎次数与不动时间[20]。经初步实验后发现，大鼠在一开始悬挂时会进行剧烈挣扎，情绪不稳定，影响对于挣扎次数与不动时间指标的观察，后经查阅大量文献，将观察时间调整为6 min，同时舍弃前2 min内大鼠的活动记录，仅记录后4 min内大鼠指标变化。

同时需要注意，应清除每次实验结束后上一只大鼠留下的粪便及尿液，避免影响下一只大鼠实验结果，同时应制止大鼠出现追求与攀爬自己尾巴的现象。分析时注意应将仅有前肢但没有后肢介入的小动作视为不动，因惯性产生的摆动也应视作不动。

3.2.2 旷场实验优化过程 旷场实验选择大小鼠开场测定仪器进行观察，初步测定时参考文献[21-22]对大鼠进入旷场后6 min内的水平跨格数、站立次数、运动距离进行观察，后发现大鼠因初次进入陌生环境会短暂因惊吓恐惧心理活动增多，但参考价值较低，应被剔除。所以最后选择只计入6 min中后4 min的数据，剔除前2 min的活动记录。

同时需要注意站立次数与水平跨格数的定义标准应固定且前后统一，3爪以上跨入临格才可纳入水平跨格数，两前肢完全离地并保持直立可被统计为站立次数；
每次旷场实验应在同一时间段内完成，避免大鼠活动周期不同对结果的干扰。保持实验室环境安静隔音，并且温湿度保持一致。两次实验间应清洁旷场仪器，避免上次动物留下残余信息影响下次实验结果。

3.3 文献方法与改进方法的比较 本实验参考文献选择复合刺激造模方法，能够从两方面来模拟人类身体疲劳与心理疲劳的病理状态，相较单因素造模更易出现疲劳状态与心理应激的改变，能有效体现机体的整体性，造模手段与病因密切相关，充分体现出该病发展的生理与病理机制，且引起的行为学改变持续时间较长[23]。在实验过程中发现，按照文献选择的造模方案存在一定问题，模型大鼠一般状态与体质量改变明显，但行为学检测结果仅有改变趋势，结果尚无统计学意义，因此，针对造模方案进行了调整，将14 d造模方法调整为21 d，同时加大造模强度，更改为单日力竭游泳与慢性束缚，并于21 d造模结束后检测发现模型成功。

在模型检验方面，国内外研究通常进一步进行动物实验了解动物的体力情况以及情绪反应，依据动物出现的体力疲劳程度与伴随出现的精神变化来判断造模成功与否[24]。因此，本研究选择CFS模型大鼠一般状态的改变以及行为学检测结果(旷场实验、悬尾实验)作为主要观察指标，判断模型的可靠性，并在此基础上，加入血清学以及组织形态学指标，作为辅助检测手段，充分观察大鼠造模后生理状态以及组织形态学改变，结果表明，造模后免疫球蛋白IgA、IgG、补体C3水平降低，肌纤维活性降低且血乳酸囤积，提示模型大鼠免疫力及体力均出现下降趋势，能充分反映大鼠的疲劳状态，结合行为学指标，从生理及心理双角度、多层次地反映模型建立情况。

本研究使用的模型检测手段也在实验过程中进行不断改进，排除实验过程中出现的多项干扰因素，如大鼠状态不稳定、实验时间段的选择、对动物行为的主观判定等，可能对结果带来的不稳定影响，规范实验的步骤与数据纳入规则，最终得到成熟有效、可重复的模型验证方法，为后续进一步检测治疗后各组间差异提供了较好的可复制方法。详见表2。

表2 文献方法与改进方法的比较

通过观察CFS模型大鼠一般状态变化、饮水量、摄食量、体质量变化以及行为学指标，对造模以及模型检测环节进行了反复验证，并加入相关血液学及免疫指标，以及对模型大鼠股四头肌组织形态学的观察。本研究对大鼠心理状态及生理变化等多项指标变化进行观察，能将模型建立情况直观量化体现出来，并能较好地对模型给予评价，可供后续相关CFS模型研究实验参考，并为其提供依据与支撑。