肿瘤干细胞的分选与培养

周瑞婷，何桂媛，李文新，梁贝贝，曾凡军

（三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院呼吸内科，宜昌 443003)

在恶性肿瘤组织中存在着一类具有高增殖能力、多向分化潜能及寿命长等干细胞特性的特殊细胞亚群，即肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSCs），它们在恶性肿瘤的起源、演进、浸润、转移、放化疗耐药、复发等方面起到关键作用。这一概念最早由Bonnet[1]于1997年提出，他们通过流式细胞仪技术，利用特定表面分子标记物CD34+／CD38+在急性髓系白血病细胞中分离出一小群与造血干细胞具有相似特征的细胞。随后，学者们陆续在乳腺癌[2]、前列腺癌[3]、结肠癌[4]等多种肿瘤组织或细胞系中证实这类细胞的存在。然而，恶性肿瘤中CSCs的占比很小，在白血病和乳腺癌中仅分别约占肿瘤细胞总数的1%[5]和2%[2]。因此，精准的分选和成功的培养CSCs是至关重要的一步。本文详细介绍CSCs的分选与培养的方法，并进一步分析其优势和局限性。

CSCs的分选方法总体上可分为依据其功能分选和细胞标志物分选两大类。常用的功能筛选试验包括侧群细胞分选法、乙醛脱氢酶活性测定法和干细胞成球试验；
细胞标志物筛选法即结合CSCs特异性标志物和先进的细胞分选技术，从而分离出高纯度的CSCs，其主要包括流式细胞分选法（fluorescence-activated cell sorting, FACS）、免疫磁珠分选法（magnetic cell sorting, MACS）和激光捕获显微切割法（Laser capture microdissection, LCM）。

1.1 功能分选法

CSCs具有一些固有功能属性，如高ATP结合盒转运蛋白表达、高乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)活性、自我更新、不对称分裂等，利用这些功能属性可以高效分离CSCs。

1.1.1 侧群细胞分选法

侧群(side population, SP）细胞是Margaret A. Goodell利用核酸染料Hoechst33342和流式细胞术进行造血干细胞分离时意外发现的一群特殊细胞，它特征性地高表达膜蛋白ATP结合盒转运蛋白家族的几个成员，可以高效率外排染料分子和化疗药物，从而导致SP细胞耐药[6]。Haraguchi等[7]从多种胃肠道肿瘤细胞系分离出SP细胞，且证实这些细胞高表达耐药性相关基因ABCG2、ABCB1和CEACAM6等，并表现出CSCs的一些特征。同样，有学者通过流式细胞术从AML患者[8]、卵巢癌[9]、胶质瘤细胞系[10]、肺癌细胞系[11]以及乳腺癌细胞[12]中分离出SP细胞。虽然SP细胞分选法不需要细胞特异性标记物进行分离，并且可利用此方法从各种组织中富集CSCs，但分离出的群体具有较高异质性。此外，由于特异性低、分离细胞纯度低、染料毒性以及染料浓度和染色时间等参数的影响，该技术的应用受到限制。

1.1.2 乙醛脱氢酶活性测定法

乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）是一组依赖烟酰腺嘌呤核苷酸磷酸（NADP）作为辅酶的催化酶，其生理功能是将内源性和外源性醛类物质氧化为相应的羧酸类物质[13]。目前，研究者们也通过检测肿瘤细胞内ALDH酶的活性来标志CSCs。

ALDH是干细胞增殖和分化的调节剂。2007年, Cheung等[14]首次利用Aldefluor实验在急性粒细胞白血病病人的肿瘤细胞中成功分离出ALDH高表达的ALDH+细胞, 并进一步证实ALDH+急性髓系白血病细胞具有肿瘤干细胞的多项特性。ALDH不仅可以作为肿瘤干细胞标记物, 其在肿瘤干细胞调控机制中可能具有更重要的作用。ALDH的一些亚型可催化细胞内的全反式视黄醛和9-顺-视黄醛成为重要的信号转导分子视黄酸。这种信号转导分子可以对细胞内多种生物学过程进行调控, 其中包括细胞的增殖、分化, 细胞周期阻滞及细胞凋亡等[13]。除此之外，ALDH还可能参与肿瘤细胞的上皮-间质转化[15]、肿瘤干细胞化疗耐药[16]及对放疗的抵抗[17]等生物学过程。

1.1.3 干细胞成球试验

成球试验是目前应用最广泛的3D体外模型，该技术使用添加生长因子（如表皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子等）的无血清培养基，在低吸附培养装置中培养单细胞悬液系统[18]。这一方法基于CSCs的锚定非依赖生长特性，即其在生长过程中对外源生长刺激因子的依赖减少，失去生长抑制效应，使其在悬浮状态下能通过克隆增殖形成球体[19]。而除CSCs之外的其他肿瘤细胞群则不具有这种特性。干细胞成球试验简单易行，不需要复杂的设备，但其难点在于区分肿瘤细胞球体和细胞聚集，而且成球的细胞为处于增殖期或准备进入增殖期的细胞，因此该模型中缺乏静止期CSCs，而静止期CSCs是肿瘤复发的主要来源，故成球细胞实验在研究药物对细胞的作用方面有一定的局限性。

1.1.4 其他功能分选法

除SP细胞法和ALDH活性测定法之外，其他常用的功能筛选试验包括利用其化学药物抗性和缺氧抗性[20]、物理属性[21]及亲脂性燃料特性[22]等。前两种方法简单便捷，但分选的细胞异质性高。利用CSCs亲脂性燃料特性的方法称为标记保留法，该方法基于CSCs的不对称分裂能力，即此类细胞相对于其他肿瘤细胞分裂较慢。因此，如果用特定的亲脂性和荧光染料标记在其细胞膜上，CSCs比其他细胞发出荧光的时间更长[22]。该方法主要用于乳腺癌中CSCs的分选[23]，最近也有研究者应用该方法成功从结直肠癌标本中分离出静止期CSCs[22]。

1.2 细胞标志物分选法

干细胞标记物是分离和识别CSCs的常用工具，但他们大多来源于造血干细胞和胚胎干细胞。结合干细胞标志物与肿瘤细胞标志物来确定肿瘤干细胞特异性的标志物, 是当前肿瘤干细胞筛选的重要手段。其中，CD44、CD133、CD24等跨膜糖蛋白被视作可靠的肿瘤干细胞标志，在多种不同的恶性肿瘤细胞系或模型中，研究者们单独或联合应用这些标记物成功地分离、鉴定了肿瘤干细胞（表1）。

表1 用于分选肿瘤干细胞的标记物Tab. 1 Biomarkers used for the isolation of CSCs

1.2.1 流式细胞仪分选法

FACS利用流式细胞仪可同时对多个标记物进行定性或定量分析, 是利用特异性标记物分离、计数和分类干细胞的最常用平台。传统的免疫荧光流式细胞术是基于荧光标记及荧光发射光谱检测的一门综合性技术, 其多为定性分析,研究者无法获得细胞形态学、检测指标的亚细胞定位等信息。成像流式细胞术（imaging flow cytometry, IFC）的出现攻克了这一技术瓶颈，因其整合了流式细胞术和荧光显微镜成像技术，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而可以更加立体完整的鉴别细胞。今天，FACS综合利用单克隆抗体技术、细胞荧光化学技术以及计算机技术，不仅能够分离含量极少的细胞, 还实现了快速精确地对单个细胞包括生物学颗粒在内等物质的理化特性进行多参数定量分选[33,34]。此外，采用质谱流式细胞技术、免疫细胞化学和免疫组化，结合高分辨率激光消融，可检测100余个细胞和亚细胞定位的生物标记物[33]。这些高通量技术可能是了解实体瘤中肿瘤干细胞异质性的有力工具。

但另一方面由于其存在成本耗费大、操作技术要求高以及容易破坏损伤细胞等缺点, 使其应用受到限制。

1.2.2 免疫磁珠分选法

MACS是最标准的细胞分离技术之一，它是利用与磁珠相连的单抗结合细胞表面特异性抗原，从而分选出相应的干细胞群体 。磁珠分选可采用高梯度磁选或低梯度磁选两种方法。其中，高梯度磁选由磁化的不锈钢珠或羊毛填充于小容量柱体中组成，它提供了一个均匀的磁场来分离用共轭磁珠标记的细胞。细胞与羊毛或珠子结合在一起，通过关闭磁场以分离被结合的细胞。MACS分为正选法和负选法，前者即磁珠结合的细胞被保留，而上清液被丢弃。后者即磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞则为所需细胞[35]。FACS与MACS的联合可近一步提高分离效率，曾有学者利用FACS对肺组织中CD133+肺癌干细胞进行了分类，并用MACS富集，与阴性对照组相比，NOD/SCID小鼠具有更高的成瘤潜能。这两种方法的联合克服了体外检测CSCs富集耗时的要求，并证实了CD133可作为肺癌干细胞标志[36]。此外，MACS还与微流控芯片进行了良好的集成，以实现以连续流动的方式对目标细胞进行分类。最近，有研究者利用CD24-/CD44+标记物，用双珠免疫磁珠分离法从乳腺癌细胞系中分离出肿瘤干细胞。简言之，在添加CD44磁珠包被抗体之前，先使用非磁珠包裹的抗体，然后使用微流控通道捕获CD24-/CD44+细胞。这种双磁珠免疫磁珠分离可使细胞分离效率从10.3%（分离前）、19.4%（仅使用抗CD44涂层磁珠）提高到41.7%[37]。MACS已成为细胞分离的有力工具，但与FACS相比，MACS在CSCs分离中的应用受到较多限制，因为MACS不能根据标记的可变表达来分离细胞，只能利用细胞表面标记。另外，分离细胞后磁珠的分离，多个标记的分离等一些问题也有待解决。

1.2.3 激光捕获显微切割

LCM的基本原理是利用激光装置发出的低能红外激光脉冲，使收集盖上的热塑膜——乙烯乙酸乙烯酯共聚物瞬间溶解，包埋特定细胞群以获得目的细胞。肿瘤微环境在维持肿瘤干细胞的干性、肿瘤生长以及转移等过程中扮演着十分重要的角色。LCM主要用于从组织样本中分离细胞[38]，因此在整体性研究肿瘤、肿瘤干细胞与肿瘤微环境上具有一定优势。由于肿瘤样本总体往往较小，为了分选出一定量的CSCs，分选效率至关重要，在流式细胞术分选法和免疫磁珠分选法中，肿瘤样本的酶解处理会导致肿瘤细胞数丢失。而LCM技术用石蜡包埋标本，再通过视觉识别、染色、免疫组化或免疫荧光染色对靶细胞进行鉴定，既可较大程度保留CSC，又可通过解剖可视化识别细胞[39]。最近，有研究者利用此方法从结肠癌患者（III期）样本中分离出ALDH阳性（CSCs群体）和ALDH阴性细胞，以分析CSCs与普通肿瘤细胞基因表达的差异[40]。此外，HeLa细胞系的活细胞也被分离出来，并使用重力转移的激光切割进行克隆性扩张[41]。由于技术的进步，LCM的一些局限性（如成像和分离固定细胞）已经得到解决，而其他如繁琐的样品制备、样品完整性的丧失等问题仍亟待解决。

相比基于CSCs功能分选方式，通过细胞标记物分选法得到的肿瘤干细胞纯度更高。但细胞标记物分选法也有一定的缺陷：首先，大多数肿瘤样本体积小，所以利用此方法分离的细胞数量有限；
第二，缺乏特异性和灵敏性俱佳的肿瘤干细胞标记物，因此需要联合使用干细胞标记物和肿瘤标记物，由此增加了分选操作的复杂程度，并影响结果的准确性；
第三，由于肿瘤样本需用酶处理（流式细胞仪分选法、免疫磁珠分选法），此过程可能严重破坏了肿瘤细胞表面抗原，分选的灵敏性将大幅降低，这可能是此方法最大的症结所在。除此之外，分离细胞的活力低、成本高以及设备复杂等多种因素都会影响实验的准确率及效率。

2 3D细胞培养法

CSCs体外培养常用的方法为在基础培养基（如DMEM、RPMI1640 等）中加入抑制细胞分化的细胞因子来筛取具有干细胞特性的肿瘤细胞。然而，这些方法为限于平板单层细胞培养的2D培养方法，不能精确的模拟癌细胞在体内的结构特征及微环境，比如形态特征、增殖分化潜能、细胞与细胞周围基质的相互作用、信号转导等，3D细胞培养技术可以弥补2D培养方法的这些缺陷。3D培养法与2D培养法主要的区别在于其培养基大多为孔径小于300 nm的纳米纤维或隙孔的支架结构，可供肿瘤细胞附着以形成三维组织结构或囊体[42]。3D培养法结合微加工技术和组织工程等先进技术，构建出多种细胞培养平台，包括多细胞球体形成（液体覆盖培养和挂滴法）、水凝胶培养、生物反应器培养、生物印刷等。其中，水凝胶培养法中所使用的胶原蛋白和海藻酸盐是3D细胞培养最常用的两种基质[43]。由于肿瘤的进展、转移与细胞外基质成分的改变密切相关，因此，与2D培养相比，在肿瘤微环境与肿瘤转移等研究领域，3D细胞培养具有明显优势[44]。①3D细胞培养可模拟肿瘤中血管的生成：肿瘤血管的生成与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。Timmins等[45]发现其构建的3D细胞培养模型（3D悬滴多细胞球体）中在加入内皮细胞后可生成微血管结构，且促血管内皮生成因子的表达明显上调。可见，具有内皮细胞的3D多细胞模型比正常2D培养更接近体内条件。②3D细胞培养可以模拟肿瘤细胞所处的缺氧环境：3D培养的球体模拟肿瘤块中的部分核心细胞因缺氧而发生基因突变[46]，缺氧条件可激活一些与CSCs密切相关的信号通路，例如Wnt、Hedgehog（Hh）和Notch等[47]，而2D培养的细胞与氧气均匀接触，不能观察到氧浓度梯度的变化。③运用3D细胞培养模型可以更好的研究肿瘤的化疗耐性。CSCs在化疗耐药性中起着重要作用，这也是症治疗失败的主要原因之一。在2D培养中，接触药物的表面积与体积比非常大，这使得药物很容易被吸收，而3D细胞培养模型能更好地模拟体内情况，用于研究药物的接种、应答和耐药性[42]。已有研究表明，3D培养模型（3D悬滴多细胞球体）对与球体结构类型相关的药物具有更大的耐药性[48]。

3D细胞培养技术也存在许多缺陷，相较于2D培养系统，它需要更高的成本和时间、较差的重复性和自动化，而且部分类型细胞在2D培养中使用的方案在3D条件下并不适用，其标准化程度较低，尤其是在细胞毒性相关试验方面。此外，3D细胞培养还需要更大的样本处理能力和专业知识[42]。

3 展望

自1994年被报道以来，肿瘤干细胞这一概念已得到了广泛的重视，成功地分选和培养是进一步研究肿瘤干细胞的前提，也是难题。20余年来，从侧群细胞培养到利用细胞标记物筛选，从2D培养到3D培养，从细胞水平到活体水平，一系列分选、培养法被逐渐确立和发展。我们认识到，一方面，这些技术上的进步将有助于我们揭开肿瘤干细胞的神秘面纱，另一方面，一些不足仍亟待解决，包括：改善肿瘤组织处理方式以减少细胞数丢失和细胞标记丧失；
寻找具有高度特异性和灵敏性的肿瘤干细胞标记，或者改进分选所用的干细胞标记和肿瘤标记物组合；
探究更多的分子生物学技术（如流式细胞术、免疫磁珠分选法）、形态学技术（如LCM）应用于肿瘤干细胞分选的可能性。