高效液相色谱法测定疏风清热合剂中黄芩苷的含量

王珂逸

(湖南中医药大学第二附属医院药剂科,湖南 长沙 410005)

黄芩为常用中药,性寒味苦,具有消炎去暑、败火清凉的作用,又称山茶根、黄金茶,临床多用于解毒泻火、除热安胎、凉血止血、清热祛湿,黄芩苷则是从黄芩根部提取分离,生物学活性显著,具有抗炎利尿、解痉抑菌的效果,近年来研究还发现黄芩苷可用于抗癌、抑制黑色素生成[1]。中药制剂疏风清热合剂中黄芩为主药,但制剂质量标准中并未对黄芩苷含量测定进行单独列相,对黄芩苷含量进行准确测定有利于更好的控制疏风清热合剂的制剂质量。目前用于测定黄芩苷的方法包括导数光谱法、分光光度法、薄层扫描法和HPLC法[2],其中HPLC法测定黄芩苷含量时通常以紫外检测器进行测定,简单可靠且重现性良好,能缩小结果与真实含量的误差。本研究的目的在于寻求疏风清热合剂制剂过程中黄芩苷质量控制方法,采取HPLC测定合剂中黄芩苷含量,报道如下。

1.1 仪器

①KQ系列硬式内镜数控超声波清洗器;②高效液相色谱仪(德国安捷伦Agilent 1260高效液相色谱仪),由四元梯度泵、紫外线检测器、柱温箱、CS-Light Potrun Anglysis色谱工作站组成;③分析型动态混合器、手动进样阀;⑤柱温箱(博纳艾杰尔CC-100分析型);⑥自制混合型烷基键合硅胶色谱柱;⑧电子分析天平。

1.2 试剂

①疏风清热合剂由本院制剂室自制;②重蒸馏水;③液相色谱专用甲醇,以磷酸为分析纯;④黄芩苷对照品(成都贝斯特,CAS号:21967-41-9,20mg/支)。

1.3 测定方法

①色谱条件。C18柱(5μm,4.6mm×250mm),柱温30℃,波长280nm,敏感性0.01AVFS,进样量为20μg/次,流动相为甲醇——水——磷酸,配比为47∶53∶0.2,流速控制在1mL/min,以黄芩苷峰计为理论板数,需≥2500。

②制备流动相。流动相A:测定前将甲醇超声30mi后冷却。流动相B:精密量取2.0mL磷酸,以重蒸馏水稀释至500mL后摇匀,获得0.2%磷酸水溶液,以G4砂芯漏斗过滤磷酸水溶液,超声30min后冷却待用。

③制备对照品溶液。在60℃温箱中将黄芩苷对照组减压干燥4h后精密称取21.26mg,并置入100mL容量瓶,加入甲醇溶液稀释至刻度,超声20min后冷却,再次加入甲醇溶液补足刻度,摇匀后待用。

④制备样品溶液。精密量取2.0mL疏风清热合剂至50mL容量瓶中,加入甲醇溶液稀释至刻度,超声溶解20min后冷却,摇匀后以微孔滤过膜过滤,滤液即样品溶液。

⑤制备阴性对照液。另取疏风清热合剂处方中除黄芩外的其他药材,按处方工艺制备不含黄芩的试剂,参照样品溶液制备方法获取阴性对照液。

⑥系统适用性试验。精密吸取对照品溶液、样品溶液和阴性对照液20μL注入高效液相色谱仪,对照品保留时间16.525min,柱效11274.4,样品保留时间16.590min,柱效10769.1,阴性对照液保留时间15.754min,柱效11509.7,观察色谱图。

2.1 色谱图分析

对照品溶液、样品溶液、阴性对照液在色谱条件下保留时间约4.1min处时,对照品和样品溶液有色谱峰出现,理论塔板数≥6000,阴性的对照液无色谱峰出现,说明黄芩苷在HPLC法测定条件下不受杂质峰干扰。

2.2 线性关系

分别精密量取0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL黄芩苷对照液置入5mL量瓶中,以1∶1的甲醇—水稀释至刻度,摇匀后经0.45μm微孔滤膜法过滤,分别精确进样20μL,检测结果见表1。

表1 黄芩苷线形关系分析结果

将对照品溶液浓度(C)设为横坐标,将其色谱峰面积(A)设为纵坐标,得出黄芩苷对照品溶液线性回归方程为A=-2.5023+0.468C,r=0.878,标准曲线结果显示在8.40～211.51μg/mL的范围内黄芩苷有良好的线性关系。

2.3 测定限值

将黄芩苷以50%甲醇溶解,配制成8.5μg/mL的浓度,在20μL精确进样,以信噪比3∶1计算可得黄芩苷最小检测量为0.05μg/mL。

2.4 样品溶液黄芩苷含量测定

分别取本院制剂室提供的三个不同批次疏风清热合剂,按“1.3”方法制备样品溶液和对照品溶液,分别精确取样20μL,在色谱条件下进行测定,以线性回归方程计算黄芩苷含量,见表2。

表2 样品溶液黄芩苷含量测定结果(n=3)

2.5 回收率

取批号20210809含量为10.851mg/mL的样品溶液6份,每份精确量取1.0mL置入10mL容量瓶中,精确量取含量0.099mg/mL的对照品溶液2.0mL、3.0mL、5.0mL各2份,以甲醇——水溶液稀释至刻度后摇匀,经0.45μm微孔滤膜法过滤后取续滤液,按“1.3”色谱条件测定,结果显示平均回收率为99.13%,相对标准差0.87%。见表3。

表2 样品溶液黄芩苷含量测定结果(n=3)

2.6 重复性

取批号20210809样品溶液,按“1.3”方法平行制备6份溶液,在色谱条件下分别进样6次,每次20μL,对色谱峰面积进行测定,结果显示黄芩苷平均色谱峰面积为56.508,相对标准差0.56%,重现性良好。

2.7 精密度

取线性关系下对照品溶液0.8mL,连续进样6次,每次20μL,结果显示黄芩苷平均色谱峰面积29.382,相对标准差0.55%,仪器精密度良好。

2.8 稳定性

①日内稳定性。取批号20210809样品溶液,制备后室温下放置,分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h时测定黄芩苷色谱峰面积,结果显示平均色谱峰面积为47.637,相对标准差0.86%,说明12h内可进行准确定量分析。

②日间稳定性。取批号20210809样品溶液,制备后室温下放置,分别在0d、1d、3d、6d、10d、15d时测定黄芩苷色谱峰面积,结果显示平均色谱峰面积为46.515,相对标准差1.08%,说明样品溶液15d内稳定性良好。

中药制剂在我国中医药学中占有重要地位,是基于传统汤、丸、丹、膏、散等经典剂型而发展到现代多个剂型和品种,对临床慢性疾病的防治有重要作用,亦可用于缓解急性疾病临床症状[3]。随着科学技术的进步,中医药事业逐步吸收了多种现代化生产技术,出现了更多的新工艺、新辅料和新剂型,而信息技术、基因技术、细胞工程等高科技技术也被不断引入中医药领域当中。在中药制剂现代化发展过程中,提高制剂的质量是首要指标。药剂质量的优劣需建立在严格的质控标准基础上,但目前我国中药制剂的质控体系尚未完善,对其应用范围造成了不良影响,如何提高中药制剂质量标准的现代化水平,成为目前中医药领域关注的重点问题。疏风清热合剂中黄芩属于主药,其含有黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、寒黄芩苷等多种黄酮类化合物,现代药理学研究表明[4],黄芩抗病毒、抗菌作用明显,对乙肝病毒、流感病毒、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有强效抑制作用。黄芩苷(Baicalin,分子式C21H18O11,分子量446.37)单品为淡黄色结晶粉末,溶解性低,能溶于甲醇但几乎不溶于水,黄芩苷能抗炎、抗变态反应、抗乙酰胆碱、抗组胺,并对抗原抗体反应过程中化学递质的释放量具有减少的作用。探讨测定疏风清热合剂中黄芩苷含量的有效方法,对提高药品质量控制水平有重要意义。

现有药典中关于中药制剂指标成分测定多以定性检测为主,甚至仅使用显微镜检定,缺乏定量检测。此外,受不同批次、不同生产商、不同地区的影响,即使是同一制剂也会存在有效含量差异,对制剂疗效造成严重影响[5]。以往测定中药制剂中某一药物含量时多采取薄层色谱法,但其准确性、精密度、敏感性、重复性较差,难以满足质控需求。随着检测方法的发展,目前用于分离、分析中药制剂的方法不断涌现,包括质谱、气相色谱、毛细管电泳、液相色谱——质谱、气相色谱——质谱、高效液相色谱法等,为中药制剂的有效含量测定和质量控制研究提供了新的方法。高效液相色谱法属于是色谱法的分支,其流动相为液体,以高压输液系统将极性不同的单一溶液或比例不同的缓冲液、混合液泵入存在固定相的色谱柱,溶液各成分在色谱柱内分离后进入紫外线检测器检测,从而实现试样分析和定量测定。有研究认为[6],80%的有机化合物均可使用HPLC进行分析检测,其具备高压、高效、高速、高准确性、适用范围广的特征,目前多用于对重要制剂中的主要成分含量进行分析。

检测黄芩苷含量时通常以C8柱或ODS柱为固定相,以甲醇——水——磷酸为流动性,通过波长276～280nm的紫外线检测器进行测定。李会婷[7]等人通过HPLC法同时测定蓝芩口服液中栀子苷、绿原酸和黄芩苷含量,以ODS色谱柱为固定相,以甲醇——磷酸溶液(45∶55)为流动性,在1.0mL/min和280nm波长的条件下结果显示黄芩苷线性范围为0.25～1.16g,r=0.999,平均回收率99.90%,标准差0.73%;郝乘仪[8]等人则以C18柱为固定相,以含0.5%磷酸的甲醇溶液为流动相进行检查,在278～324nm波长条件下测定,结果显示黄芩苷保留时间为4.8min,与相邻峰分离度>1.5,回收率97.8%,相对标准差0.55%,以上研究结果均提示HPLC能同时测定试剂中的多种有效成分含量。本研究中,紫外线检测器以200～400nm波长范围进行扫描,在280nm波长处吸收最大,且样品溶液的其他成分未对黄芩苷色谱峰造成影响,因此以280nm作为黄芩苷含量测定的最佳检测波长;但考虑到黄芩苷存在较强的极性,因此采取反向HPLC进行测定;在流动相选择方面,配比为47∶53∶0.2的甲醇——水——磷酸出峰时间最合适且峰型满意。在以上色谱条件下保留时间4.1min时对照品和样品溶液有色谱峰出现,阴性对照液无此色谱峰,提示HPLC测定黄芩苷可避免其他杂质峰干扰。

综上所述,高效液相色谱法测定疏风清热合剂黄芩苷含量简单快速,且测定结果准确,可用于制剂的质量控制。