HPLC法同时测定甲状腺片的含量及含量均匀度

赵 栋

(滁州市食品药品检验中心,安徽 滁州 239000)

现在国内生产甲状腺片是用猪、牛等的甲状腺体作为原料,经过一系列的生产工艺制成。临床用于各种原因引起的甲状腺功能减退症[1]。本文使用链霉蛋白酶(P5147)-HPLC法检验其中的T3和T4含量及含量均匀度[2]。并对样品进行质量评价,从质量方面考察临床上治疗效果差异[3]。本实验在四年中检验了3家企业36批甲状腺片样品。

1.1 仪器

LC-20AD型高效液相色谱仪(SPD-20A检测器, Labsolutions工作站);HC-3018高速离心机(安徽中科中佳公司);S220型pH计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];BT25S型半微量天平(北京赛多利斯);BSA224S分析天平(北京赛多利斯)。

1.2 试药

甲状腺片(基本药物和高风险药品专项抽验样品),T3、T4均来自中国食品药品检定研究院;HPLC淋洗剂级乙腈,链霉蛋白酶(P5147)、2-巯基-1-甲基咪唑、三(羟甲基)氨基甲烷都产自国药公司,氨水、磷酸等为国药集团生产的分析纯。

2.1 系统适用性

试验色谱柱:Diamonsil plus C18(250mm×4.6mm,5μm);调整流动相的比例,最终确定的流动相:水-乙腈-磷酸(700∶300∶5);检测波长λ=230nm;流速1.0mL/min;进样量:20μL,柱温:30℃。在此条件下,T3、T4与相邻峰分离良好,且峰形尖锐,无杂峰干扰。色谱峰见图1、2。

图1 空白液

2.2 重复性和理论

板数取同一混合对照品溶液连续进样5次,T3峰面积RSD=0.2%,T4峰面积RSD=0.1%,左甲状腺素峰的理论板数为14000。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品

溶液精密称取左甲状腺素对照品和碘塞罗宁对照品置100mL量瓶中,加水-乙腈-浓氨溶液(500∶500∶1)混合溶液50mL,涡旋使溶解,用50%乙腈溶液定容,摇匀,作为对照品储备液。精密量取5mL,置250mL量瓶中,用还原性缓冲溶液[称取氯化钠6.435g,三羟甲基氨基甲烷4.846g和他巴唑5.708g,置1000mL量瓶中,用水溶解并定容,摇匀,用6mol/L盐酸溶液调PH值至8.40]稀释至刻度,摇匀,精密量取5mL,置带螺帽试管中,精密加入1%磷酸乙腈溶液2mL,振荡,用一次性针头过滤器(0.45μm)过滤,取续虑液,即得。

图2 甲状腺片对照

2.3.2 供试品

溶液取甲状腺片20片,精密称定,研细,精密称取适量,置预先充有氮气的带螺帽试管中,尽量减少在空气中暴露的时间,精密加入蛋白水解酶溶液(1mg/mL)5mL,缓缓通入氮气流5min,盖上螺帽,摇匀,置带盖的水浴中38℃水解28小时(避光,注意确保其分散)后,精密加入1%磷酸乙腈溶液2mL,振荡,以每分钟2000转离心5min,取上清液用微孔滤膜滤过(弃去初滤液1mL),即得供试品溶液。

2.3.3 阴性样品

溶液的制备为考察试剂的干扰,不加供试品,其它与供试液同法操作,制得空白液。

2.4 样品测定

按上述方法,四年时间分别测定36批甲状腺片的含量及含量均匀度,见附图3、4,结果见表1、2、3。

表1 不同厂家甲状腺片含量测定结果

图4 甲状腺片样品含量均匀度

3.1 质量标准提高的临床意义

甲状腺片为甲状腺激素药,能有效补充患者体内缺乏的甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3),特别是T3。药典标准的提高,用有效成分T3、T4作为质控的指标,增加T3、T4含量均匀度的检查,使甲状腺片的质控手段已与左甲状腺素钠片(LT4)一致[4],可以更安全、有效的在临床上使用甲状腺片。

3.2 统计分析

由表1可见:A、B、C厂甲状腺片中T3(RSD<6.33%)和T4(RSD<5.88%)含量的批间差异不大。A厂T3、T4总体平均值要略高于B、C厂。因A厂家T4含量比B、C厂略高,T4在体内脱碘转为T3,发挥治疗作用。A、B厂是薄膜衣片,C厂是薄膜衣片和糖衣片,规格都是40mg,A、B两厂其产品为两年的保质期,C厂其产品为三年的保质期,所有样品均在保质期内,结果能体现甲状腺片的质量现状。表2、3可见:运用EXCEL软件对甲状腺片的T3、T4含量均匀度数据进行统计分析,根据t检验:双样本异方差假设计算结果表明,α<0.05,P>0.05,显示A、B、C3厂T3、T4含量均匀度差异无统计学意义,结果见表4。

表2 不同厂家T3含量均匀度测定结果

表3 不同厂家T4含量均匀度测定结果

表4 t-检验:双样本异方差假设

3.3 其他成分

甲状腺片含量图谱中除T3、T4外,还有其他峰,可能为猪源蛋白、MIT、rT3及无机碘化合物的吸收峰。