规模猪场猪呼吸道疾病病原诊断实例分析

李东风 ，秦子昂 ，王丽霞 ，陈芳芳 ，常 红

（1.安徽省兽药饲料监察所，安徽 合肥 230091；
2.安徽洪桥中科基因技术有限公司，安徽 合肥 231131；
3.山西省检验检测中心，山西 太原 030012）

猪呼吸道疾病在规模猪场多发和常见，往往是细菌性和病毒性疾病混合感染。目前，猪场对猪呼吸道病原菌的检测步骤主要为病症观察，病料收集，病料培养基接种，抗体检测，细菌的分离、纯化、鉴定，核酸电泳等。现将安徽某猪场出现呼吸道症状的病猪病原分离鉴定案例报告如下：

1.1 实验材料

1.1.1 病料来源

病料来源于安徽某发病猪场60日龄小猪，具有呼吸困难、高热昏睡、肺部纤维素样病变等呼吸道系统症状，送检两块肺部组织。

1.1.2 培养基和试剂

培养基：大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）、胰胨肉汤培养基（TSB）、血平板培养基。

生化试剂：5×TBE缓冲液、1.0%琼脂糖凝胶、磁珠法核酸提取试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光PCR检测试剂和猪圆环病毒2型通用型实时荧光PCR检测试剂、氧化酶试纸和触酶试剂。

抗生素药敏纸片：头孢噻呋、恩诺沙星、替米考星、氟苯尼考、氨苄西林、泰妙菌素、链霉素、环丙沙星、阿莫西林。

1.1.3 仪器设备

超纯水处理系统购买于苏州邦泽净化设备有限公司，超净工作台购买于苏州安泰空气技术有限公司，生物安全柜购买于苏州苏洁医疗器械有限公司，恒温培养箱购买于美国SHELLAB 公司，凝胶成像分析系统购买于北京六一生物科技有限公司，稳压稳流电泳仪和水平电泳槽购买于北京六一生物科技有限公司，微量高速离心机购买于上海净信实业发展有限公司，荧光PCR仪购买于重庆京因生物科技有限公司，冰箱产自青岛海尔特种电器有限公司，全自动核酸提取仪购买于赛默飞示尔科技有限公司，显示器检测显微镜购买于赛默飞示尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 病原菌的分离和纯化

取不锈钢托盘置于生物安全柜中，平铺上一层一次性塑料袋，点燃酒精灯，对镊子、接种环进行灼烧灭菌。用镊子从密封袋中夹出猪肺病料，轻放在托盘中，用镊子夹起酒精棉球对猪肺的表面进行擦拭消毒。更换酒精棉球并用酒精灯点燃，再次对病料表面擦拭，弃棉球于装满水的1 000 mL烧杯中灭火。用镊子夹起猪肺组织一角轻轻提起，用无菌剪刀剪出一个截面，再从截面向内剪下一块约1 cm3大小的深层组织，分别蘸于TSA平板上，用接种环进行四区划线，37℃恒温培养 18～24 h。

取出恒温箱中的培养基，在1号的TSA培养基上，生长有两种形态的菌落，一种无色透明、光滑湿润、针尖状，记为a菌，另一种呈半透明、表面光滑湿润、露珠状的圆形菌落，记为b菌。在2号的TSA培养基上，生长有与b菌菌落形态相同的菌落，记为c菌。另取三块TSA培养基，用接种环分别挑取以上三种细菌单个菌落进行四区划线，恒温箱中37℃培养18 h。

将分离后得到的3种菌再次挑取单菌落接种于TSA培养基上进行四区划线，由于细菌纯度已经较高，每划线一个区域，都需要进行灼烧灭菌处理，最后才能得到单个菌落。恒温箱中37℃培养18 h。

1.2.2 革兰氏染色镜检

取两块载玻片，向中心滴1滴生理盐水，用接种环分别挑取纯化后的a和b菌单菌落，先点到中心，再陆续向外均匀涂抹于载玻片上，等待自然干燥后进行短时间火焰固定。用革兰氏染液进行快速染色，置于显微镜下，于载玻片上滴上香柏油1滴，用1000×油镜镜检。

1.2.3 氧化酶和触酶试验

取3个载玻片，在中心各滴上1滴生理盐水，用接种环依次挑取纯化后的TSA平板中的3种菌的单个菌落，均匀涂布在载玻片上，再分别滴入过氧化氢试剂1-2滴，若有气泡产生则为阳性，若没有气泡产生则为阴性。

取氧化酶试纸3张，用生理盐水浸湿，用接种环分别挑取3种细菌单个菌落，在试纸上从左到右来回涂抹，若观察到试纸在1 min之内变为蓝紫色，记为氧化酶阳性；
若试纸1 min内没有变色，记为氧化酶阴性。

将纯化后的3种菌，用接种针分别挑取单个菌落，接种于TSB液体培养基中，加入等体积的甘油封装保存备用。

1.2.4 药敏试验

进行药敏试验的药品有：头 孢 噻 呋（Ceftiofur）、 恩诺 沙 星（Enrofl oxacin）、 替 米考 星（Tilmicosin）、 氟 苯 尼考（Florfenicol）、 氨 苄 西 林（Ampicillin）、泰妙菌素（Tiamulin）、链 霉 素（Streptomycin）、 环 丙 沙星（Ciprofl oxacin）、 阿 莫 西 林（Amoxicillin）共9种。

取出保存细菌的TSA液体培养基，另取两个TSA培养基和两个西林瓶，瓶中加入生理盐水至中位线，分别用接种环挑取a菌和b菌于西林瓶中，配制比浊度为4的菌悬液。将无菌棉签浸润在菌悬液中，挤出多余的液体，在TSA培养基上密集、来回划线，顺时针方向旋转培养基，继续连续划线，确保接种液涂抹均匀，直到培养基旋转至初始位置，最后紧贴平板的内壁涂抹两圈。用记号笔在培养基底盖上划分出9个大小相等的区域便于放置药敏片。

用镊子依次夹起各药品的药敏片，先轻轻垂直放置于培养基的表面，随后按住药敏片一侧缓缓将其平放，这样可使镊子不触及培养基避免要反复灼烧灭菌，造成实验过程过长，影响实验结果，涂菌后应在15 min之内贴上药敏片。将贴好药敏片的TSA培养基放入37±1℃恒温培养箱中培养18 h，次日用游标卡尺读取抑菌圈大小判定耐药性。

1.2.5 分子生物学鉴定

在超净工作台上，取1枚八联管，将存放于TSB液体培养基中的a、b、c3种菌液，分别用移液器取200μL的样品加入八联管中，再吸取20μL的裂解液，放入离心机中离心半分钟混合均匀后放入核酸提取仪中，启动程序。2 h后将提取好的核酸样品进行荧光PCR的体系配置。

使用磁珠法核酸提取试剂，加入反应液 20μL，酶 1μL，4μL的核酸提取液，离心混合均匀，放入荧光PCR仪中，设定参数：95℃预热 5 min 变性，95℃ 5 s，57℃ 15 s，72℃40 s反应40个循环，72℃延伸15 min。

分别进行猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌、猪链球菌的荧光PCR检测。判定标准为：有扩增曲线且Ct值≤35为阳性；
35＜Ct值≤38为可疑；
Ct值＞38为阴性。

之后进行体系配置，取微型离心管1只，加入12.5 μLMix，DD水5 μL，副猪嗜血杆菌的上下游引物各1 μL，最后加入4.5 μL细菌a的核酸样品，离心混合均匀后放入PCR仪中进行扩增。

称取0.75 g琼脂糖粉末加入250 mL锥形瓶中，再向锥形瓶中加入20 mL的5×TBE缓冲液，摇匀后放入微波炉中加热2～3 min使其完全溶解，随后滴入溴化乙锭5 μL，摇晃均匀倒入泳道模板上自然冷却20 min。

将配置好的琼脂糖凝胶溶液倒入泳道模板中，定型后取出插孔，抹掉模板下方溢出的琼脂并放入点泳池中，将扩增好的a菌核酸用移液器吸取5 μL加入到第5个孔中，在第2个孔中加入5 μL阴性对照，在第3个孔中加入5 μL阳性对照，在第1个 孔 中 加 入 2000 BPMark5 μL，接通电泳仪的电源以100～120 v电压进行核酸电泳45 min。电泳完成后，倒出模板上的琼脂，放入凝胶成像分析系统进行紫外照射得到电泳图。

2.1 病料接种

肺组织接种的TSA平板区域生长有3种形态的菌落。一种无色透明、光滑湿润、边缘整齐、针尖状菌落，另外两种菌落形态特征相似，其一呈半透明、表面光滑湿润、露珠状的圆形菌落；
其二呈半透明、表面光滑湿润、露珠状的圆形菌落。结果如图1。

图1 病料TSA培养基接种图

2.2 革兰氏染色镜检

经过革兰氏染色后，置于油镜下观察：a菌呈革兰氏阴性短小丝状杆菌，两头钝圆；
b菌呈革兰氏阳性球菌，单个或多个链状排列；
c菌呈呈革兰氏阳性球菌，单个或多个链状排列。故a疑似副猪嗜血杆菌，b和c疑似为猪链球菌。染色结果如图2和图3。

图2 a菌革兰氏染色镜检图（1000×）

图3 b菌和c菌革兰氏染色镜检图（1000×）

2.3 溶血试验和卫星试验

取两块血平板接种环分别挑取b菌和c菌单菌落进行四区划线接种，恒温箱中37±1℃培养18～24 h得到纯化后的细菌。其中在TSA上的3种菌菌落形态与初步分离时相同，在血平板上的细菌呈细小圆形、边缘整齐并有溶血环现象，试验结果如图4，符合链球菌的菌落特征。

图4 b菌和c菌血平板划线培养图

另取血平板1块，挑取纯化后的a菌单个菌落，在血平板上横向平行划线，灼烧接种环，再从金黄色葡萄球菌标准菌株平板上挑取金黄色葡萄球菌，在血平板左右各三分之一处垂直于a菌的线划线，恒温箱中37℃培养18 h，进行卫星实验。实验结果如图5，a菌大多数集中于金黄色葡萄球菌的周围生长，分布密集，远离金黄色球菌的地方菌落稀疏。

图5 卫星试验结果图

2.4 氧化酶和触酶试验结果

触酶试验观察到a有产生大量气泡的现象，记为触酶阳性。b和c没有气泡产生记为触酶阴性。氧化酶试验观察到a菌的试纸在1 min之内变为蓝紫色，记为氧化酶阳性。b和c菌的试纸没有变色，记为氧化酶阴性。

以上细菌鉴定结果如表1所示。

表1 细菌鉴定实验结果记录表

2.5 病原菌生物学鉴定结果

根据初步实验结果来看，a菌疑似副猪嗜血杆菌；
b菌和c菌疑似猪链球菌，依此为进一步试验的基础结论。

2.6 荧光PCR鉴定

2.6.1 猪链球菌PCR扩增

猪链球菌PCR扩增结果如图6所示，阳性对照Ct值处于正常范围内，且b菌和c菌Ct值均小于阳性对照，故判定病料存在猪链球菌感染。

图6 猪链球菌PCR扩增曲线

2.6.2 副猪嗜血杆菌PCR扩增

副猪嗜血杆菌PCR扩增结果如图7所示，阳性对照Ct值处于正常范围内，且a菌Ct值＜35，故判定病料存在副猪嗜血杆菌感染。

图7 副猪嗜血杆菌PCR扩增曲线

2.6.3 猪圆环病毒2型PCR扩增

猪圆环病毒2型PCR扩增结果如图8所示，阳性对照Ct值处于正常范围内，35＜样品Ct值≤ 38，故结果判定为可疑，该猪可能存在猪圆环病毒2型感染。

图8 猪圆环病毒2型PCR扩增曲线

2.6.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR扩增

猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR扩增结果如图9所示，样品无Ct值，判定为该猪没有猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。

图9 猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR扩增曲线

2.7 琼脂糖凝胶电泳结果

由图10电泳图谱可知，样品的bp值位于750 bp和1 000 bp之间，位置与阳性对照相同，bp值为822 bp，故a菌为副猪嗜血杆菌。

图10 副猪嗜血杆菌琼脂糖凝胶电泳图

2.8 药敏试验结果

药敏试验结果如表2所示。副猪嗜血杆菌对头孢噻呋、恩诺沙星、氟苯尼考、阿莫西林敏感性极高，对替米考星、泰妙菌素中度敏感，对氨苄西林、链霉素、环丙沙星耐药。猪链球菌对头孢噻呋、恩诺沙星敏感性极高，对氨苄西林、泰妙菌素、阿莫西林中度敏感，对替米考星、氟苯尼考、链霉素、环丙沙星耐药。

表2 副猪嗜血杆菌和猪链球菌的药敏试验结果判断表

本实验成功从样品肺组织中分离出副猪嗜血杆菌和猪链球菌，并检测出病料组织存在猪圆环病毒2型感染，不存在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。对于猪呼吸道病原的鉴定，首先应当根据临床症状以及发病前的管理程序结合当地流行病学史初步确定可能的病原体，再取病猪临床症状明显的组织或器官如肺、喉头接种于营养成分丰富的培养基如TSA，确保苛养菌能够正常生长。对培养出来的菌落观察其形态特征，通过革兰氏染色镜检进一步筛选出符合条件的细菌并做出假设。随后进行氧化酶试验和触酶试验，初步验证假设后进行荧光PCR鉴定和琼脂糖凝胶电泳鉴定。

该鉴定过程中时刻需要注意无菌操作，所有器材使用前必须经高压灭菌，实验过程中必须全程在超净工作台和生物安全柜中进行。细菌的初步分离纯化是鉴定过程中最关键的步骤，必须纯化出单个菌落才能进行之后的实验操作，因此操作者应熟练四区划线手法，一区划线后需要对接种环进行灼烧后才能继续划线，否则很难生长出单个菌落。

此方法能够在48 h内迅速确定病原体，操作简洁，步骤严谨、符合逻辑，且鉴定所需仪器试剂和设备中小型猪场实验室内均可设立。普通PCR需要人工进行核酸提取，需要多次添加试剂进行离心，操作复杂且样品易受污染。而本实验采取的荧光PCR只需使用商业化的PCR检测试剂盒，加入模板和引物后放入荧光PCR仪中，选择设定好的程序即可进行PCR反应，且通常反应在1～3 h内，通过反应的Ct值即可判断感染情况。