紫花苜蓿根腐病生防菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

刘博，蒲乐莹，陶科，金洪，侯太平

（四川大学生命科学学院/生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川成都 610064）

【研究意义】紫花苜蓿（Medicago sativa）为多年生豆科牧草，具有营养价值高、适应能力强、适口性好等优点，被誉为“牧草之王”，是我国种植面积最大的牧草品种（黄炜和文亦芾，2018）。研究表明，紫花苜蓿在水土保持、土壤改良、植物修复以及他感作用等生态功能方面发挥着一定作用（吴开贤和罗富成，2008）。然而，根腐病的发生成为限制紫花苜蓿产业发展的因素之一（王梓，2020）。紫花苜蓿根腐病是一种危害严重的土传性根部病害，其病原种类复杂，不同地区存在差异，但多与镰刀菌（Fusariumspp.）有关，如尖孢镰刀菌（F.oxysporium）、燕麦镰刀菌（F.avenaceum）、变红镰刀菌（F.incarnatum）和木贼镰刀菌（F.equiseti）等（方香玲等，2019；
张园园等，2021）。根腐病可在土壤中快速蔓延，使苜蓿根部腐烂直至中空，侧根死亡，分枝减少，固氮和养分吸收能力均受到影响，从而导致牧草产量和质量下降，草地利用年限缩短（潘龙其等，2015；
支旭欣，2020）。目前苜蓿根腐病在我国西北、华北和东北的主要苜蓿种植区大面积发生，对我国苜蓿产业发展造成重大影响（田慧，2021），筛选抗病品种是当前防治该病害的最有效途径，但需要较长的时间才能发挥效果（杨剑锋，2021）。生物防治具有安全、绿色、高效的优点（Gouli et al.，2021）。青藏高原地理位置和生态环境特殊，可能生活着在基因、代谢等方面产生特有生物学机制的微生物。因此，从青藏高原环境中筛选易培养、效果好、适应性强的拮抗菌为紫花苜蓿根腐病的生物防治提供了新方向，对苜蓿产业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】目前对苜蓿根腐病的控制方法主要有化学农药防治和筛选抗病品种（李国良等，2019；
杨剑锋等，2020；
张园园等，2021）。然而，化学农药防治存在易残留、病原菌易产生抗药性等问题，而筛选抗病品种费时费力，因此学者将目光投向了生物防治。针对苜蓿根腐病拮抗菌的研究已有报道。刘莎莎等（2015）从紫花苜蓿根际土壤中筛选出2株对紫花苜蓿根腐病病原菌具有抑制活性的菌株，经鉴定分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CYY-6和短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）CYY-42。张丹（2016）从采集自黑龙江省农业科学院内的苜蓿植株中分离出绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）等6株内生菌，均对苜蓿根腐病病原菌具有良好的抑制效果。胡进玲等（2017）从紫花苜蓿根部分离出2株内生拮抗菌，分别为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）LYZ0069和卡那霉素链霉菌（Streptomyces kanamyceticus）LYZ0133，2株拮抗菌对紫花苜蓿根腐病病原菌及叶片病害病原菌均具有良好的抑制效果。曾亮等（2019）从紫花苜蓿根际土壤中分离筛选出2株拮抗菌，鉴定为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和康宁木霉（T.koningii），对峙法测定结果2株拮抗菌对4种镰刀菌的抑制率在54.9%～75.3%。骆丹等（2020）研究发现，绿色木霉（T.viride）对苜蓿根腐病病原菌有较好的抑制效果。刘彦超等（2021）从紫花苜蓿茎部和根部分离出80株内生细菌，采用平板对峙法从中筛选出9株对苜蓿根腐病菌抑制率高于61.00%的细菌，其中1株类芽胞杆菌属（Paenibacillus）菌株MS-43对根腐病菌的抑制率达63.96%。Li等（2021）从紫花苜蓿根际土壤中分离筛选出1株苍白杆菌属（Ochrobactrumsp.）细菌菌株I-5，研究发现菌株I-5的发酵滤液对三线镰刀菌（F.tricinctum）孢子产生、萌发和菌丝生长均具有抑制作用，抑制率分别达76.67%、78.93%和55.77%。青藏高原平均海拔在4000 m以上，紫外辐射强、日照时间长，特殊的生境孕育着特殊环境适应性和特殊生物学机制的微生物资源。郑有坤（2015）对青藏高原采集的土壤进行了放线菌物种多样性分析，并从中筛选出11株对三七根腐病病原菌具有较强抑制作用的放线菌菌株；
贾丹丹（2019）从青藏高原环境中筛选出46株生防芽胞杆菌，这些菌株在抑菌、促生和抗逆方面具有较高的活性。【本研究切入点】生物防治对环境友好，研发周期相对较短，是苜蓿根腐病防治研究热点之一。生活在青藏高原的微生物可能在抑菌活性和抗逆性等方面具有特殊的性质，为筛选更多高效、易培养的苜蓿根腐病拮抗菌提供了新方向，但目前针对苜蓿根腐病生防菌的相关研究较少，且大部分研究仅针对单一病原菌。【拟解决的关键问题】以青藏高原的健康紫花苜蓿根际土壤为研究对象，以紫花苜蓿根腐病5种病原菌为靶标，采用稀释涂布法、平板对峙法和菌丝生长速率法从中分离筛选拮抗菌株，继而对筛选出的拮抗菌株进行分类鉴定和发酵条件优化，以确定拮抗菌株的分类地位并提高其抑菌效果，旨在为高抑菌菌株的进一步开发应用提供理论基础。

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品采集地紫花苜蓿根际土壤采集地位于四川省阿坝州红原县四川省草原科学研究院试验地内（北纬32°47′，东经102°32′），海拔3500 m。

1.1.2 供试病原菌紫花苜蓿根腐病病原真菌：木贼镰刀菌、变红镰刀菌、燕麦镰刀菌、织球壳枯萎菌（Plectosphaerella cucumerina）和尖孢镰刀菌，均由中国农业科学院草原研究所提供。

1.1.3 培养基PDA培养基、NA培养基和NB培养基。发酵基础培养基：葡萄糖5 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂18 g/L，pH 7.0。

1.1.4 试剂与仪器主要试剂：革兰氏染色液、芽胞染色液和细菌生理生化鉴定管，均由青岛海博生物技术有限公司提供。主要仪器：DSX-280KB30手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；
BS-1E恒温震荡培养箱（金城海澜仪器设备厂）；
SWCJ-1FD超净工作台（浙江苏净净化设备有限公司）；
3K15高速冷冻离心机（美国Sigma生物科技有限公司）；
SPH-250恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 紫花苜蓿根际土壤采集于2021年8月进行土壤样品采集。在长势良好的健康紫花苜蓿植株附近，采用五点取样法和抖土法（唐涛等，2022）采集紫花苜蓿根际土壤。首先去掉0～5 cm的表层土壤，将根际土壤抖落后，用毛刷轻轻将根表面的土壤刷下；
将土壤样品中的残根等杂物去除后混匀，用四分法留取土样，装入无菌塑封袋并放入冰盒中保存，带回实验室进行后续处理。

1.2.2 拮抗菌株的分离与纯化利用稀释涂布法分离紫花苜蓿根际土壤细菌（周德庆和徐德强，2013）。将土壤样品配制成10-1～10-6浓度的悬液，分别取上述浓度的土壤稀释液100μL均匀涂布于NA培养基表面，30℃条件下恒温培养。挑取形态、大小和颜色有明显差异的菌落进行纯化。采用平板划线法将菌落纯化3～4次（周德庆和徐德强，2013），直至观察到有单菌落出现，将单菌落转接至斜面培养基试管中，置于冰箱4℃冷藏备用。

1.2.3 拮抗菌株筛选利用平板对峙法筛选拮抗菌株（李枢妍等，2021）。将活化好的病原真菌用直径6 mm打孔器打成菌饼，置于PDA培养基中央，将菌丝的一面朝下，再将分离纯化获得的细菌以十字交叉法接种在距离菌饼2.5 cm处，28℃条件下培养4～7 d后，用十字交叉法测量菌落直径后计算抑制率。试验重复3次。抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100。

1.2.4 拮抗菌株发酵滤液的抑菌活性测定发酵滤液的制备参考Mu等（2020）的方法并略有改动。将活化好的拮抗菌株接种于NB液体培养基中，30℃下180 r/min培养24 h，制成种子液；
将3 mL种子液转接到发酵基础培养基中，30℃下180 r/min培养48 h后，4℃下10000 r/min离心20 min，取上清液；
用0.22μm过滤器反复过滤后备用。采用菌丝生长速率法测定发酵滤液的活性（Dong et al.，2021）。将发酵滤液以20%的含量加入PDA培养基中，制成带毒培养基，并加入50μL/mL的硫酸链霉素；
将病原真菌接种在带毒PDA培养基中央，28℃下培养4～7 d后，测量菌落直径并计算抑制率。试验重复3次。抑制率（%）=（对照组直径-处理组直径）/（对照组菌落直径-6 mm）×100。

1.2.5 拮抗菌株形态观察及生理生化鉴定平板划线后，观察拮抗菌株在培养基上的菌落形态，用细菌微量生化鉴定管对拮抗菌株进行生理生化鉴定（布坎南和吉本斯，1984；
东秀珠和蔡妙英，2001）。将拮抗菌株进行革兰氏染色和芽胞染色后，置于油镜下观察。将拮抗菌株接种到NB液体培养基中，振荡培养24 h左右，离心，收集菌株，加入2.5%戊二醛固定（孙明明等，2020），将样品送至成都里来生物科技有限公司进行扫描电镜观察。

1.2.6 拮抗菌株16S rRNA序列测定及系统发育进化树构建使用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（成都擎科生物科技有限公司）提取拮抗菌株的DNA。PCR扩增引物为27F（5′-AGAGTTTGATCMT GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACG ACTT-3′）。PCR反应体系50μL：1×TSE101金牌Mix 45μL，正、反向引物（10μmol/L）各2μL，DNA模板1μL。扩增程序：98℃预变性3 min；
98℃10 s，55℃15 s，72℃15 s，进行39个循环；
72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。将所得序列上传至NCBI，通过BLAST进行比对。利用MEGA 7.0采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树。将序列上传至GenBank数据库，得到相应的登录号（Kumar et al.，2016）。

1.2.7 拮抗菌株的发酵培养基优化拮抗菌株发酵滤液制备及发酵滤液活性测定同1.2.4。以发酵滤液抑菌活性为指标，先采用单因素试验对碳源、氮源及无机盐进行优化，每处理3次重复，初步选出最佳因子。碳源：葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油；
氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、酵母浸粉；
无机盐：NaCl、KH2PO4、CaCO3、MgSO4。选取抑菌活性最好的单因素的最佳浓度及上下2个浓度，设计3因素3水平正交试验，获得发酵培养基的最佳配方（曲远航等，2022）。

1.2.8 拮抗菌株的发酵条件优化拮抗菌株的发酵滤液制备及发酵滤液活性测定同1.2.4。以发酵滤液抑菌活性为指标，在最佳发酵培养基配方的基础上优化其发酵条件，每处理3次重复。初始pH：将培养基的pH分别调成5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5；
接种量：分别以1%、2%、3%、4%、5%和6%的接种量接入菌种；
培养温度：将培养基分别置于20、25、30、35和40℃下培养；
装液量：在250 mL锥形瓶中分别设置60、80、100、120和140 mL的装液量；
培养时间：分别培养12、24、36、48和60 h；
摇床转速：设置120、150、180、210和240 r/min的转速（张颖等，2021）。

1.3 统计分析

试验数据使用Excel 2019和SPSS 16.0进行分析，并用Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析。

2.1 拮抗菌株筛选结果

从采集自青藏高原的紫花苜蓿根际土壤中共分离纯化出92株细菌，采用平板对峙法测定92株细菌对5种紫花苜蓿根腐病病原菌的拮抗效果，结果（表1）显示，92株细菌中有16株细菌对不同病原菌具有抑制作用，其中，菌株L-1、LJ3-1、Z-21、Z-22和Z-23具有较广谱的抑菌活性。菌株LJ3-1对5种供试病原菌的抑制率均在60.0%以上，其中对燕麦镰刀菌和织球壳枯萎菌的抑制率分别为72.4%和70.2%，综合各拮抗菌株的抑菌广谱性和抑菌能力，选择菌株LJ3-1作为目标拮抗菌进行后续试验。菌株LJ3-1对5种病原真菌的平板对峙结果见图1。

表1 拮抗菌株对紫花苜蓿根腐病病原菌的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of antagonistic strains against root rot pathogens of alfalfa

2.2 菌株LJ3-1发酵滤液抑菌活性测定结果

采用菌丝生长速率法对菌株LJ3-1发酵滤液的抑菌活性进行测定，结果（表2）显示，菌株LJ3-1发酵滤液对引起紫花苜蓿根腐病的5种病原菌表现出不同的抑制活性，其中，发酵滤液对燕麦镰刀菌的抑制效果最好，抑制率达77.4%；
对织球壳枯萎菌也有较强的抑制效果，抑制率为75.7%；
对其他几种紫花苜蓿根腐病病原菌也均产生相应的抑制效果。因此，后续进行菌株LJ3-1的抑菌活性测定时以燕麦镰刀菌作为活性追踪指示菌。

表2 菌株LJ3-1发酵滤液对紫花苜蓿根腐病病原菌的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of strain LJ3-1 fermentation filtrate against root rot pathogens of alfalfa

2.3 菌株LJ3-1鉴定结果

2.3.1 菌株LJ3-1的形态观察及生理生化鉴定菌株LJ3-1在NA培养基上于30℃培养24 h后观察，菌落呈近圆形，边缘不规则，粗糙，有褶皱（图2-A）。在光学显微镜下观察到革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，有芽胞存在（图2-C和图2-D）。形态观察显示菌株LJ3-1具有明显的芽胞杆菌特征。扫描电镜观察菌体形态，可观察到其细胞呈杆状，有的呈链状排列，细胞长、宽分别为1.0～2.0μm和0.3～0.6μm（图2-B）。

菌株LJ3-1的生理生化鉴定结果（表3）显示，该菌能液化明胶，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，可利用甘露醇和木糖发酵，不能利用阿拉伯糖发酵，不能利用丙酸盐，接触酶反应呈阳性，V-P反应阳性，能水解淀粉，能在3% NaCl和7% NaCl胰胨水中生长。参照《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001），初步鉴定菌株LJ3-1为枯草芽胞杆菌（B.subtilis）。

表3 菌株LJ3-1的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LJ3-1

2.3.2 菌株16S rRNA序列测定及系统发育进化树构建以菌株LJ3-1的总DNA为模板对16S rDNA序列进行PCR扩增，扩增产物送至成都擎科梓熙生物公司完成测序，发现菌株LJ3-1的16S rDNA序列长度为1450 bp。将菌株LJ3-1的16S rDNA序列上传至NCBI的GenBank数据库中获得登录号为OL757697.1。将菌株LJ3-1的16S rDNA序列上传至NCBI数据库进行搜索比对，并下载相似序列，用MEGA 7.0的NJ法构建菌株系统发育进化树。从图3可看出，菌株LJ3-1与枯草芽胞杆菌（B.subtilis）多个菌株相似性达99%以上，故将其鉴定为枯草芽胞杆菌。

2.4 菌株LJ3-1发酵条件优化

2.4.1 菌株LJ3-1发酵培养基组分优化单因素试验筛选出的发酵培养基组分结果如图4所示，当碳源为2%葡萄糖（图4-A）、氮源为2%酵母浸粉（图4-B）、无机盐为0.5% NaCl时（图4-C）菌株LJ3-1的抑菌活性最强。

根据单因素试验筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐及其最佳浓度，设计3因素3水平正交试验，结果（表4）显示，RC＞RA＞RB，说明无机盐组分对菌株LJ3-1发酵滤液抑菌活性影响最大，其余依次为葡萄糖和酵母浸粉，其最佳组合为A3B1C2，即菌株LJ3-1最佳发酵培养基组分为3%葡萄糖、1%酵母浸粉、0.5% NaCl。

表4 菌株LJ3-1发酵培养基的正交试验结果Table 4 Orthogonal experiment results of fermentation medium for strain LJ3-1

2.4.2 菌株LJ3-1的发酵条件优化由图5可看出，当发酵滤液的初始pH为5.0～6.5时，菌株LJ3-1的抑菌活性呈上升趋势，在pH 6.5时抑菌活性最强，其后随着pH增大抑菌活性减弱，因此，发酵滤液的初始pH应控制在6.5～7.0（图5-A）；
当接种量为3%时，菌株LJ3-1的抑菌活性最强，因此，选择3%的接种量进行种子液的接种（图5-B）；
当发酵温度为35℃时菌株LJ3-1的抑菌活性最强，因此，选择35℃作为发酵温度（图5-C）；
在250 mL锥形瓶中，装液量为80 mL时菌株LJ3-1的抑菌活性最强，因此，在250 mL锥形瓶中装液量为80 mL最佳（图5-D）；
当发酵时间在12～36 h时菌株LJ3-1的抑菌活性呈上升趋势，36 h时达最大值，随后开始下降，因此，选择发酵时间为36 h（图5-E）；
当摇床转速为120～180 r/min时菌株LJ3-1的抑菌活性呈上升趋势，当转速为180 r/min时抑菌活性最强，随后开始下降，因此，选择摇床转速为180 r/min（图5-F）。

为比较基础发酵培养基与优化的发酵培养基的抑菌活性，以燕麦镰刀菌为指示菌，采用生长速率法测定2种发酵液的抑制率，结果（图6）显示，在优化的发酵条件下菌株LJ3-1对燕麦镰刀菌的抑制率达89.3%，相较于基础发酵培养基的抑制率（76.5%）显著增加12.8%（绝对值）（P＜0.05，下同），说明优化后的培养基更有利于活性物质的产生。

近年来，随着紫花苜蓿种植面积的扩大，根腐病危害也随之上升，由于农牧业自身的生产特点、环境保护和食品安全等方面的要求，化学农药的使用受到制约（Zhao et al.，2021），人们迫切需要安全、绿色、环保、经济的生物防治资源，如生防菌。芽胞杆菌是被广泛应用在植物病害防治上的生防菌，并已被开发成多种生物菌剂应用于农业生产（Hyakumachi et al.，2013；
O’Brien，2017）。枯草芽胞杆菌是被研究和开发最广的生防芽胞杆菌，有研究表明，枯草芽胞杆菌对灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和香蕉枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.cubense）均有良好的抑制作用（Touréet al.，2004；
Furuya et al.，2011；
郑臻，2016）。芽胞杆菌在牧草病害上的应用也有报道，张丹（2016）分离筛选出2株紫花苜蓿内生菌Y1和Y5，经鉴定均为枯草芽胞杆菌，2株菌株对尖孢镰刀菌的平板对峙抑制率分别为54.05%和52.70%；
梁艳琼等（2020）筛选出1株解淀粉芽胞杆菌（B.amyloliquefaciens），该菌株对柱花草炭疽病具有良好的抑制效果。本研究从青藏高原的紫花苜蓿根际土壤中分离出92株细菌，通过平板对峙法筛选出1株对紫花苜蓿根腐病多种病原菌具有抑制作用的细菌LJ3-1，平板对峙结果显示，菌株LJ3-1对5种供试紫花苜蓿根腐病病原菌的抑制率均在60.0%以上，对燕麦镰刀菌和织球壳枯萎菌的抑制率分别为72.4%和70.2%；
通过菌丝生长速率法验证了其发酵滤液的抑菌活性，结果显示，发酵滤液对燕麦镰刀菌的抑制效果最好，抑制率达77.4%，对织球壳枯萎菌也有较强的抑制效果，抑制率为75.7%；
通过形态学和分子生物学等方法综合鉴定，确定其为枯草芽胞杆菌。

生防菌株会产生一些代谢产物从而抑制病原菌的生长，通过发酵培养基和发酵条件优化可提高其代谢产物的产量（Zhong et al.，2014）。刘扬科等（2021）对枯草芽胞杆菌YT168-6的发酵条件进行优化，结果表明，该菌株的最佳发酵培养基组分为：可溶性淀粉30.2 g/L、蛋白胨23.6 g/L、玉米浆18.2 g/L、K2HPO45 g/L、MgSO410 g/L，优化后的发酵条件使其抗菌肽sublancin产量提高2.09倍。因此，发酵条件优化对生防菌的开发和应用具有重要作用。本研究以发酵滤液抑菌活性为指标，通过单因素试验和正交试验对枯草芽胞杆菌菌株LJ3-1进行发酵培养基优化，结果表明，最适发酵培养基组分为：3%葡萄糖、1%酵母浸粉和0.5% NaCl。本研究结果与刘扬科等（2021）的研究存在一定差异，原因可能是不同菌株对发酵培养基的喜好不完全相同，菌株LJ3-1产生的抑菌物质可能不是抗菌肽sublancin。本研究仅在摇床条件下对发酵培养基组分进行优化，今后尚需在发酵罐中进一步验证，在实际生产应用中对发酵培养基组分的成本控制也需进一步探究。

本研究在优化的发酵培养基基础上进行了菌株LJ3-1的发酵条件优化，结果显示，最适pH为6.5～7.0，说明该菌株更适宜在偏酸的环境中生长代谢。本研究的土壤采集地位于红原县，张雪莲（2015）在对红原人工草地的土壤理化性质研究中发现，该地区大部分土壤偏酸性；
马丽（2021）在对红原高寒草地土壤的理化性质研究中也得到相同结论。推测菌株LJ3-1更适宜在偏酸的环境中生长代谢可能与其生存的土壤环境有关。菌株LJ3-1在发酵温度35℃时生长良好、最佳接种量为3%、摇床转速以180 r/min为宜、最佳装液量为80 mL、发酵时间在36 h时抑制率最高，随后开始下降，抑制率下降的原因可能是菌株生长进入后期，而发酵培养基中的营养成分消耗殆尽，导致活性物质产量下降。基于优化的培养基配方及发酵条件下，菌株LJ3-1发酵滤液的抑菌活性达89.3%，显著高于优化前的培养基。本研究从青藏高原紫花苜蓿根际土壤中筛选出的菌株LJ3-1具有较好的生防菌开发潜力，关于菌株LJ3-1的抑菌机理等相关问题是下一步研究的方向。

以青藏高原采集的紫花苜蓿根际土壤为研究对象，用平板对峙法和菌丝生长速率法筛选出1株对紫花苜蓿根腐病5种病原菌均具有抑制效果的拮抗菌株LJ3-1；
对筛选出的菌株LJ3-1进行发酵条件优化，提高了其抑菌活性。菌株LJ3-1具有较强的抑菌效果，可作为研制苜蓿根腐病生物防治菌剂的候选菌株资源。