白术提取物调控miR-96抑制AngⅡ诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移和侵袭

杨燕 杨新 李秀芬 比拉里

(1新疆医科大学附属中医医院心内科，新疆 乌鲁木齐 830000；
2新疆维吾尔自治区人民医院心电学科)

血管平滑肌细胞(VSMCs)主要功能是血管收缩，其异常增殖导致动脉粥样硬化(AS)斑块的形成，VSMCs的表型转换可促进AS的慢性炎症发生〔1〕。中药方剂或提取物可有效阻止AS斑块形成或改善损伤〔2〕，研究其抑制机制可能发现AS的分子治疗靶点。血管紧张素(Ang)Ⅱ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要活性肽激素。它在内皮功能障碍，血管重塑和血管炎症中起作用，这与包括AS和高血压在内的多种疾病密切相关〔3〕。半夏白术天麻颗粒在治疗颈AS痰浊阻络证的临床疗效上安全有效〔4〕，且含有白术等多种中药的理脾化痰方可抗早期AS及抑制VSMC增殖〔5〕，白术水煎液可以保护脑微血管内皮细胞免受过氧化氢损伤，对血管相关病变具有一定的预防和治疗作用〔6〕。目前白术对VSMC的影响机制尚不清楚。有研究表明，miR-96在AS患者中高表达〔7〕，miR-96为骨形态发生蛋白(BMP)调节VSMC收缩表型的调节剂，BMP作用VSMC可使miR-96表达下调，进而维持VSMC收缩表型〔8〕。本研究探讨白术提取物对AngⅡ诱导的人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs)的增殖、迁移和侵袭的影响及潜在分子机制。

1.1材料 HUASMCs购自北纳生物；
白术饮片购自中药材市场，经新疆医科大学附属中医医院中药师鉴定为白术根茎；
AngⅡ购自北京索莱宝科技有限公司；
胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚钢(DMSO)和四氮唑蓝(MTT)购自Sigma-Aldrich公司；
DMEM高糖培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；
Transwell板购自美国Corning公司；
引物、miR-96 mimics(miR-96)、miR-96抑制物(anti-miR-96)和阴性对照(miR-con和anti-miR-con)购自上海生工生物工程股份有限公司；
Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂TRIzol、反转录试剂盒(RT-PCR) 和real-time PCR 试剂盒购自美国Invitrogen公司；
细胞周期蛋白(Cyclin)D1抗体、p21抗体、鼠抗人E钙黏附蛋白单克隆抗体(E-cadherin)抗体、基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体和GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司；
显微镜、酶标仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司；
二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2白术提取物的制备〔9〕根据文献〔9〕制备白术提取物，将100 g白术饮片粉碎，加入500 ml甲醇，超声提取30 min，重复3次，纱布过滤，合并滤液。将滤液进行0.22 μm滤膜过滤，然后旋转蒸发浓缩，真空干燥，得白术提取物干粉10 g。实验时配制成磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，过滤除菌备用。

1.3细胞培养、药物处理〔5,8〕细胞培养：将HUASMCs细胞培养于含10% FBS、1% 青-链霉素的DMEM高糖培养基中，在湿度95%、37℃ 且5% CO2培养箱中培养，消化传代。

药物处理：将AngⅡ溶解于PBS配制成1×103mol/L并过滤除菌，使用时加入培养液中，配制成所需浓度。根据预实验结果，用1×107mol/L AngⅡ处理HUASMCs 48 h，收集细胞进行后续实验。将AngⅡ诱导后的HUASMCs细胞接种于96孔板培养过夜，然后加入终浓度为125 ng/ml、250 ng/ml和500 ng/ml的白术提取物，对照组加入空白培养液，继续培养24～72 h，进行实验。

1.4细胞转染 用DMEM高糖培养液稀释对数生长期的HUASMCs，以2×105个细胞/孔接种于6孔板中，培养细胞待细胞至融合度为80～90%，根据转染试剂说明书操作将anti-miR-con、anti-miR-96、miR-con和miR-96转染HUASMCs，转染48 h，收集细胞，验证转染效果，进行后续实验。转染分组：miR-96抑制组(转染anti-miR-con和anti-miR-96)、miR-96过表达组(转染miR-con和miR-96)。

1.5qRT-PCR检测RNA表达 收集各组AngⅡ诱导、经白术提取物处理或(和)转染的HUASMCs，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，用反转录试剂盒反转录合成cDNA，以cDNA为模板按照 real-time PCR的说明书进行反应合成miR-96，反应程序为：95℃ 4 min；
94℃ 30 s、59℃ 40 s、72℃ 30 s，40个循环；
72℃ 5 min。miR-96引物序列为5′-CTGCCTTGAGTGCTCCTA-3′(上游)和5′-CCTGACACAAGGATGCAG-3′(下游)。用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.6MTT实验检测细胞存活率 收集AngⅡ处理后、白术提取物处理和(或)转染的HUASMCs，胰酶消化细胞，收集细胞并稀释，以2×103个/孔接种于96微孔板中，培养液中加入白术提取物(终浓度分别为125 ng/ml、250 ng/ml和500 ng/ml)，对照组中加入等体积的空白培养液，待细胞培养至24、48、72 h时进行 MTT 实验，酶标仪测定490 nm 吸光度(A)值。存活率=A实验组/A对照组×100%，抑制率=100%-存活率。

1.7Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 迁移实验：收集转染或处理后的各组HUASMCs，用含无血清DMEM高糖培养基将细胞稀释为2×105个/ml。取100 μl细胞加入24孔Transwell上层小室，同时加入实验浓度的白术提取物，对照中加入等体积的空白培养液，下层小室加入500 μl含10%FBS的DMEM高糖培养基，将上层小室放入下层小室中，培养24 h，取出上层小室，弃培养液，洗涤2遍，用棉签擦去上层小室未迁移的细胞，甲醛固定细胞10 min，结晶紫染色30 min，显微镜计数5个视野，取均值。

侵袭实验：将液化过夜的Matrigel用培养液1∶3比例稀释，取100 μl加入上层小室，在超净工作台过夜固化，上层加入稀释的细胞和白术提取物，下层加入含FBS的培养液。其余步骤同迁移实验。

1.8Western印迹实验 收集转染、AngⅡ处理或(和)白术提取物处理的各组HUASMCs，裂解细胞并超声破碎，离心收集蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酶胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白条带，转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗，CyclinD1抗体(1∶3 000)、p21抗体(1∶2 000)、E-cadherin抗体(1∶2 000)、MMP-2抗体(1∶2 000)和GAPDH抗体(1∶5 000)，4℃过夜孵育。洗膜2次后加入稀释的酶标二抗，室温孵育2 h。以GAPDH为内参照，Quantityone软件进行图像分析，以目的蛋白与内参照蛋白条带灰度值之比来分析蛋白水平。

1.9统计学处理 采用SPSS19.0软件进行t检验和方差分析。

2.1白术提取物抑制AngⅡ诱导的HUASMC增殖 根据预实验结果，选择具有最佳的促增殖作用的1×107mol/L AngⅡ刺激HUASMCs 48 h。与对照组相比，AngⅡ组HUASMCs中CyclinD1表达明显升高，p21蛋白表达明显降低，细胞OD值在24 h、48 h和72 h均显著升高(P<0.05)。与AngⅡ组相比，AngⅡ+白术提取物125 ng/ml组、AngⅡ+250 ng/ml组和AngⅡ+500 ng/ml组HUASMCs中CyclinD1表达明显下降，p21蛋白表达升高，细胞OD值在24 h、48 h和72 h均显著下降(均P<0.05)，且均呈现显著的剂量依赖趋势，见表1和图1。说明白术提取物可抑制AngⅡ诱导的HUASMCs增殖。根据结果，选择对HUASMCs抑制率约为50%的白术提取物250 ng/ml浓度进行后续实验。

表1 白术提取物对AngⅡ诱导的HUASMC增殖的影响

1)与对照组比较；
2)与AngⅡ组比较；
3)与AngⅡ+白术提取物125 ng/ml组比较,4)与AngⅡ+白术提取物250 ng/ml组比较:均P<0.05

1～5：对照组，AngⅡ组,AngⅡ+白术提取物125 ng/ml组，ANGⅡ+白术提取物250 ng/ml组,AngⅡ+白术提取物500 ng/ml组图1 白术提取物对AngⅡ诱导的HUASMC增殖蛋白表达的影响

2.2白术提取物抑制AngⅡ诱导的HUASMC迁移和侵袭 与对照组相比，AngⅡ组HUASMCs中MMP-2表达明显升高，E-cadherin蛋白表达明显降低，迁移和侵袭细胞数均显著增多(均P<0.05)；
与AngⅡ组相比，AngⅡ+白术提取物250 ng/ml组HUASMCs中E-cadherin表达明显升高，MMP-2蛋白表达明显降低， 迁移和侵袭细胞数均显著下降(均P<0.05)，见图2和表2。

2.3白术提取物抑制AngⅡ诱导的HUASMC中miR-96表达 与对照组(0.25±0.02)相比，AngⅡ组HUASMCs中miR-96表达显著升高(0.88±0.09，P<0.05)；
与AngⅡ组相比，AngⅡ+白术提取物250 ng/ml组HUASMCs细胞中miR-96表达显著降低(0.34±0.03，P<0.05)。

2.4抑制miR-96可抑制AngⅡ诱导的HUASMC增殖、迁移和侵袭 与AngⅡ+anti-miR-NC组相比，AngⅡ+anti-miR-96组HUASMC中miR-96、CyclinD1和MMP-2表达显著降低，p21和E-cadherin表达显著升高，细胞OD值在24 h、48 h和72 h、迁移和侵袭细胞数均显著降低(均P<0.05)，见图3、表4。

2.5过表达miR-96能逆转白术提取物对AngⅡ诱导的细胞HUASMC增殖的影响 与AngⅡ+白术提取物250 ng/ml+ miR-NC组相比，AngⅡ+白术提取物250 ng/ml+miR-96组细胞中miR-96表达显著升高，CyclinD1表达明显升高，p21表达明显降低，细胞OD值在24 h、48 h和72 h均显著升高(均P<0.05)，见表5、图4。

图2 白术提取物对AngⅡ诱导的HUASMC迁移、侵袭的影响(结晶紫染色)

1，2：AngⅡ+anti-miR-NC组,AngⅡ+anti-miR-96组

图3 抑制miR-96对AngⅡ作用的HUASMC增殖迁移、侵袭蛋白表达的影响(结晶紫染色)

表4 抑制miR-96对AngⅡ作用的HUASMC增殖、迁移、侵袭的影响

表5 过表达miR-96能逆转白术提取物对AngⅡ诱导的HUASMC增殖的影响

1，2：AngⅡ+白术提取物250 ng/ml+miR-NC组,AngⅡ+白术提取物250 ng/ml+miR-96组；
图5同图4 过表达miR-96能逆转白术提取物对AngⅡ诱导的HUASMC增殖蛋白表达的影响

2.6过表达miR-96能逆转白术提取物对AngⅡ诱导的HUASMC迁移、侵袭的影响 与AngⅡ+白术提取物250 ng/ml+ miR-NC组相比，AngⅡ+白术提取物250 ng/ml+ miR-96组细胞中miR-96表达显著升高，E-cadherin表达明显降低，MMP-2表达明显升高，迁移和侵袭细胞数均显著增多(均P<0.05)，见图5、表6。

图5 过表达miR-96能逆转白术提取物对AngⅡ作用的HUASMC迁移、侵袭蛋白表达的影响(结晶紫染色)

表6 过表达miR-96能逆转白术提取物对AngⅡ作用的HUASMC迁移、侵袭的影响

VSMC的异常调控在AS的发展过程中发挥重要功能，了解VSMC在AS中的行为对于确定防治AS的治疗靶点至关重要〔10〕。AngⅡ可通过激活血管NAD(P)H氧化酶来刺激活性氧的生成，从而引起血管多种生理病理作用，参与血管重塑、炎症、钙化和AS等过程〔11〕。AngⅡ常用于构建AS体外血管模型〔3〕。白术是菊科植物白术的干燥根茎，一种常用的中药材〔12〕。

白术有效成分主要是内酯类、多糖、挥发油类和总黄酮物质等，具有抑菌、抗炎、抗氧化、调节脂类代谢等功能〔13〕。白术挥发油成分对肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌和结肠癌细胞均具有不同程度的抑制作用〔14〕。白术还用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病，与其他方剂合用，可显著提高临床疗效，改善心血管功能，提高生存质量〔15,16〕。本研究所用的白术提取物包含挥发油和内酯类成分〔9〕，本研究验证了白术提取物对可抑制AngⅡ诱导的HUASMCs增殖、迁移和侵袭，说明白术提取物对AS具有潜在抑制作用。

miR-96可能与血小板功能和反应活性相关，而血小板活化在AS的发展和进展中起着关键作用，AS后期常出现致命缺血事件，因此miR-96可能是心血管疾病的潜在诊断和治疗标志物〔17〕。研究表明，miR-96-5p在AS患者中高表达，具体作用机制尚不清楚〔7〕。miR-96可显著抑制肝细胞中高密度脂蛋白受体(SR-BI)的表达，SR-BI的过表达能有效促进胆固醇逆转运，减少AS的发生〔18〕。本研究认为，白术提取物可能通过调控miR-96抑制AngⅡ诱导的HUASMCs增殖、迁移和侵袭。本研究结果也发现，miR-96在AngⅡ诱导的HUASMCs中高表达，250 ng/ml白术提取物可逆转AngⅡ对HUASMCs中miR-96表达的促进作用，抑制miR-96表达；
通过抑制和过表达miR-96发现，抑制miR-96表达可抑制AngⅡ诱导的HUASMC细胞增殖、迁移和侵袭，过表达miR-96可逆转白术提取物对AngⅡ诱导的HUASMCs细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，说明白术提取物通过抑制miR-96表达来抑制AngⅡ诱导的HUASMCs细胞增殖、迁移和侵袭。