CALCR,基因和自噬相关基因在非小细胞肺癌中的相关性研究#

何弢 谭志巍 王乔羽 谢雨芹 龚刘萍 张燕琴 刘沙,△

（1.成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院，四川 成都 610057；
2.成都医学院药学院，四川 成都 610500；
3.空军第986 医院药剂科，陕西 西安 710054）

肺癌是全球高发病症，并且致死率很高，我国肺癌患病人数在2015 年就达到了73.33 万[1]。肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（Nonsmall-cell lung cancer，NSCLC），其 中 以NSCLC 最为常见，占所有肺癌种类的 85%-90%[2]。非小细胞肺癌早期症状不明显，确诊时多为晚期，外科手术已经不适宜作为治疗手段，因为经过手术切除治疗的非小细胞肺癌患者的复发和转移率较高，术后病人的总体生存率也较低[1]。而NSCLC 的分子靶向治疗取得了明显的进展，例如厄洛替尼对NSCLC 有很强的抑制作用[3]，索拉菲尼在NSCLC 的I 和II 期临床实验中取得了较满意效果[4]。因此更好的挖掘NSCLC 发生发展的作用机理对于开发抗NSCLC 药物具有较强临床价值。

研究表明 G 蛋白偶联受体（G-proteincoupled receptor,GPCRs）属于七次跨膜受体，参与了多种细胞信号传导过程，与许多人类疾病的发生、发展以及预后有密切的联系，是一种重要的细胞表面受体，CALCR 属于GPCRs 其中之一[5]。CALCR（也称为CTR），位于染色体7q21.3上，既是降钙素激素受体，也是细胞外钙传感器，是一种具有双重功能的跨膜肽[6,7]。但是CALCR在非小细胞肺癌中的相关文献资料极少，故本实验对CALCR 在NSCLC 组织中的表达情况进行评价。

细胞自噬是一个重要的细胞代谢过程之一，可作为NSCLC 的治疗靶点。细胞自噬是一种细胞内降解途径，其功能主要是维持机体内环境稳定，此过程通过清除损坏的蛋白或细胞器来完成[8]。研究表明细胞自噬在NSCLC 的发生发展过程中起双重调控作用。一方面通过维持基因组稳定性、抑制氧化应激等方式在正常细胞中发挥抗肿瘤作用并抑制肿瘤转移；
另一方面，自噬能为癌细胞提供能量、能促进癌细胞对缺氧以及氧化应激等的适应、能促进肿瘤的转移与侵袭等[9]。目前对于自噬与NSCLC 之间联系已经有了较多的研究进展，但是针对NSCLC组织中CALCR的表达情况与细胞自噬相关性的研究依旧很少，故本实验基于此做了进一步的探索，以对NSCLC与CALCR 的研究提供更多的参考。

1.1 材料

酶标仪（成都锦世昌祥科技有限公司，中国），电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，中国），电泳仪和凝胶成像仪（BIO RAD，美国），台式高速离心机（赛默飞世尔科技有限公司，美国），超纯水装置（四川优普超纯科技有限公司，中国），高通量快速匀浆器（MP Biomedicals，美国）。

1.2 试剂

BCA 蛋白试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，中国），蛋白电泳上样缓冲液5×（康为世纪生物科技有限公司，中国），彩色预染蛋白（安徽欣伯玉生物科技有限公司，中国），GAPDH 一抗、Beclin-1 一抗、ATG5 一抗及ATG13 一抗（Proteintech，美国），CNR2 一抗及CNR1 一抗（Affinit，美国），P53 一抗（上海泊湾生物科技有限公司，中国），鼠抗兔IgG 二抗，羊抗鼠IgG 二抗（上海泊湾生物科技有限公司，中国）。

1.3 方法

1.3.1 研究对象

2021 年9 月到2022 年1 月共收集成都医学院第二附属医院核工业四一六医院20 对原发性非小细胞肺癌肺组织样本。

所有患者均未进行手术治疗并对患者的临床病历资料（年龄、性别、病理结果、分期、家族史、吸烟情况、肿瘤部位及肿瘤直径等）进行收集（见表1），其中男性6 例，女性14 例，年龄39-85 岁，TNM 分期为I-II 期。所有患者均知情同意并签署知情同意书，并获得了核工业四一六医院伦理委员会的伦理批准。

表1 患者的临床资料

1.3.2 Western blot

将保存于-80℃冰箱的组织加入RIPA 裂解液通过匀浆仪研磨，研磨后的组织匀浆利用离心机以12 g 离心20 min 取上清液。提取的上清液利用BCA 试剂盒测定蛋白浓度并对样品浓度进行适度调整，确定需要添加的SDS-PAGE Loading Buffer（Reducing，5×）（康为世纪公司）体积以及上样体积。最后将样品标记好编号并金属浴10 min，置于-20℃保存。制胶完成后，每孔加入等量蛋白，通过12% 浓度的聚丙烯酰胺凝胶开展电泳，待电泳完成后，开始利用PVDF 转膜。转膜后利用5% BSA 室温下封闭1 h 后，与相应的一抗进行孵育，包括抗P53抗体（1:1000），抗Beclin-1 抗体（1:1000），抗ATG5 抗体（1:1000），抗 ATG13 抗体（1:1000），抗 CALCR 抗体（1:1000），抗GAPDH 抗体（1:2000）。一抗孵育完成后，利用TBST 在常温摇床上清洗5 次，每次5 min。并利用辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000）室温孵育2 h。最后将条带均匀覆盖发光液后通过凝胶成像仪曝光查看结果。利用Image-J计算条带灰度值，并以GAPDH为内参对照，计算目的蛋白与GAPDH 灰度比值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验。采用Spearman 等级相关分析对CALCR 与ATG5、ATG13、Beclin-1 及P53 蛋白之间进行相关性分析。运用Graphad 软件描绘柱状图。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.1 NSCLC 组中CALCR 蛋白表达情况

如图1 所示，与正常组（癌旁组织）比较，NSCLC 组中的CALCR 蛋白表达水平明显上调（P＜0.001）。

图1 Western blot 测定NSCLC 癌组织及癌旁组织中CALCR 蛋白的表达情况

2.2 NSCLC 组CALCR 水平与临床特征参数之间的关系

如图2 所示，在NSCLC 组织中，CALCR 蛋白水平在性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小等临床特征参数上未见组间显著性差异（P＞0.05）。

图2 分析CALCR 蛋白在不同病理特征的表达情况

2.3 NSCLC 组中自噬相关蛋白表达水平

如图3 所示，与正常组（癌旁组织）比较，NSCLC 组中ATG5，ATG13，p53 及Beclin-1 蛋白表达明显下调（P＜0.05）。

图3 Western blot 测定NSCLC 癌组织及癌旁组织中ATG5、ATG13、Beclin-1 及p53 蛋白的表达情况

CALCR 为降钙素基因，是体内最强的一种舒血管神经肽，广泛分布于中枢，心血管及肺组织，并通过自分泌和旁分泌的方式作用于肿瘤细胞表面的肽类受体，在肿瘤的不同调控机制方面展现了较好的作用[10-12]。研究表明，CALCR 通过IL-2 增强细胞存活率，也可抑制NK 细胞的杀伤活性导致肿瘤细胞生长，总体刺激癌细胞分裂增殖[13,14]。同时，肺癌患者的血浆中CALCR 较正常人显著升高，并随肺癌浸润范围和病情加重[15]。因此，CALCR 是肿瘤生长的重要调节因子。本研究发现CALCR 蛋白表达水平在NSCLC 组织中高表达，可能通过激活腺苷酸环化酶，通过升高cGMP 从而松弛平滑肌，导致血管扩张，且血流加快，促进细胞增殖[16]。同时，本研究的临床病理因素分析显示，CALCR 蛋白与患者年龄，性别，肿瘤直径大小及肿瘤部位无相关性。且TNM 分期中未观察到表达上差异性，可能是由于临床样本数量有限导致差异性不明显。

自噬在肿瘤进程中频繁发生。在肿瘤初期，基础水平的自噬通过降解细胞中受损成分或蛋白质从而抑制肿瘤的发生。而在肿瘤晚期，自噬通过维持肿瘤细胞的基本代谢功能促进肿瘤生长，存活及恶性肿瘤的发生[17]。比如增强肿瘤的应激耐受性和提供营养来满足细胞的代谢需求，从而促使肿瘤细胞即使在不良的环境下也能维持细胞存活。因此，自噬对于肿瘤的发生发展过程中起到正负双向调控功能。本研究中，下调的自噬蛋白提示在NSCLC 中已不能维持基本水平的自噬，促进肿瘤的发生。本研究使用TNM分期为I-II期的患者标本，主要倾向于肿瘤早期，这与使用的临床样品相吻合。由于肿瘤抑制基因p53 在自噬调节中发挥双重调节作用：一方面，细胞核内的p53 通过发挥其转录因子潜能从而促进自噬发生；
另一方面，胞浆内的p53通过抑制AMPK 活性从而抑制自噬[18]。本研究中，发现P53 蛋白和自噬相关蛋白均下调，表明P53 可能发挥转录因子潜能从而诱导自噬。自噬体的形成与ATG 系列基因有关，如ATG5 是一种自噬相关基因，通过与ATG12形成ATG5-ATG复合体，参与自噬体膜的形成与延伸[19]。ATG13 是肿瘤抑制器和细胞能量状态的传感器，可影响能量消耗刺激自噬[20]。Beclin-1 是酵母ATG6 的同系物，其是哺乳动物参与自噬的特异性基因，主要与III 型PI3K 形成复合物来促进其它的ATG蛋白如ATG5和ATG13在自噬前体结构中定位，从而调节自噬活性[21]。研究表明Beclin-1 的低表达促进肺癌，结肠癌，卵巢癌等进程，此过程可能与促进凋亡有关。Beclin-1 过表达抑制肺癌细胞的生长，血管生成，促进凋亡等[22]。因此，Beclin1、ATG5 和ATG13在自噬体的定位，自噬囊泡的形成和扩展中起着重要作用。

本研究发现NSCLC 中Beclin-1、ATG5 及ATG13 蛋白下调，表明以上蛋白在NSCLC 中发挥抑癌作用，提示自噬活性在NSCLC 中降低，自噬体形成减少，自噬发生强度减弱。同时在相关性分析中发现CALCR 蛋白表达水平与ATG5蛋白表达水平无相关性，而CALCR 蛋白表达水平与ATG13、P53、Beclin-1 蛋白表达水平呈显著正相关，推测促癌基因CALCR 与抑癌基因p53 协同抑癌，导致细胞自噬能力降低，内环境稳定性下降。CALCR 与ATG13 及Beclin-1 蛋白表达水平呈正相关，与ATG5 蛋白表达水平无相关性，提示CALCR 抑制可促进自噬囊泡的形成及定位，但对自噬囊泡的延伸无影响。此过程可能是由于 CALCR 作为降钙素基因，可激活PI3K/Akt/mTOR 通路，从而抑制 ATG13 及Beclin-1 的表达[23,24]。

综上所述，本研究结果表明，CALCR 和自噬相关蛋白参与了NSCLC 的病理进程，两者指标可协同作为诊断NSCLC 的有效标志物，可称为疾病治疗的靶标。