青蒿油对皮肤屏障损伤模型小鼠及皮肤微生态的干预作用研究

黄 虎，杨志波，万江波，陶 侃，郭莉莉，秦紫嫣，何彰华，刘 兴

（1.上海上美化妆品股份有限公司全球研发中心，上海 200065；
2.湖南中医药大学第二附属医院皮肤科，湖南 长沙 410005；
3.昆药集团股份有限公司，云南 昆明 650106；
4.湖南讴睿生物科技有限公司，湖南 长沙 410205）

皮肤是机体抵御外界有害刺激的保护屏障。长时间暴露在紫外线（UV）下对皮肤屏障的结构和功能存在直接损害作用，可诱发皮肤过早的光老化、色素沉着、炎性反应和癌变[1]。因此，需寻找一种天然的皮肤保护化合物以避免UV对皮肤带来的损伤。青蒿是中医治疗中常用的中草药[2]，研究发现[3]，青蒿以及其有效成分可通过调控T淋巴细胞功能以及IL-10、TNF-α治疗光敏感性皮肤病、系统性红斑狼疮、湿疹等疾病，还可通过抑制皮肤癣菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌及糠秕孢子菌等治疗感染性皮肤疾病。青蒿油（artemisia naphta oil，AN）作为在青蒿素中提取的活性成分，在治疗皮肤病方面也存在巨大潜力。基于此，本研究拟探讨AN对UV诱导的皮肤屏障损伤模型小鼠的干预作用及对皮肤微生物的影响。

1.1 实验动物 8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司）80只。本研究通过湖南中医药大学第二附属医院动物伦理委员会批准，所有小鼠饲养温度为20 ℃～26 ℃，相对湿度为40%～70%，自由摄食、饮水，严格遵循国家动物饲养规则饲养1周后进行实验。

1.2 试剂与仪器 无菌无酶水（北京索莱宝生物科技有限公司），吐温20、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），AN（上海上美化妆品股份有限公司）；
皮肤测试仪（德国CK公司，型号：Derma-Expert MC760）。

1.3 AN的提取与配制 共同加热青蒿叶与石油醚后过滤出含AN的溶液，蒸发去除过滤液中的石油醚，100 ℃～110 ℃下蒸馏得到AN粗产物；
将AN粗产物放入精炼罐中110 ℃加热30 min后冷却；
加入硅胶，搅拌30 min后过滤脱色。配制0.5%、1.0%、1.5%、3.0%、5.0%AN（换算成人体使用浓度分别为0.055%、0.11%、0.16%、0.30%和0.55%）：分别将50 μl、100 μl、150 μl、300 μl、500 μl AN加入至400 μl吐温20中，使用无菌无酶水稀释至10 ml。

1.4 动物分组及皮肤屏障损伤模型构建 80只小鼠适应性喂养1周后，根据随机数字表法分为Control组、Model组、NC组、0.5%AN组、1.0%AN组、1.5%AN组、3.0%AN组、5.0%AN组，每组10只。Control组不做任何处理，其余组小鼠进行紫外线灯照射，单位面积能量为1200 MJ/cm2，每次照射20 min，1次/d，连续照射7 d，至小鼠皮肤有明显干燥、皮屑、泛红、角质层变薄症状，构建皮肤屏障损伤模型。造模成功后开始进行相应浓度的AN或Base水（NC组）干预，将不同浓度AN按照相应分组进行喷雾给药，连续干预两周后取材并进行相应检测。

1.5 小鼠背部皮肤损伤观察 肉眼观察小鼠背部皮肤屏障损伤情况；
使用皮肤测试仪检测小鼠皮肤水分、油份、纹理、肤色、色素等皮肤指标，并在镜下观察拍照对比，正白光下观察小鼠背部皮肤的干性、油性及毛囊堵塞、头皮衰老情况；
UV光下观察皮肤感染情况。

1.6 16 S rRNA测序流程 每组随机收集4只小鼠的皮肤拭子，采用Illumina NovaSeq PE250系统（上海伟寰生物科技有限公司）进行16S扩增子测序，获取下机原始数据，并对原始数据进行去接头、过滤及去除嵌合体序列等操作，得到可以用于后续分析的有效序列。本研究采用Qiime 2分析流程，基于下机原始数据获得OTU、ASV等信息，通过进行物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况，确定各组皮肤菌群结构；
进一步观察各组小鼠的α多样性指数、β多样性指数及PCA分析，根据样本内物种丰富度和均匀度等信息分析不同样本和分组的群落结构差异。

1.7 统计学方法 使用GraphPad 7.0处理本研究数据，最终数据由三次独立实验结果的（±s）表示；
统计显著性采用LSD-t检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验；
P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01、P＜0.001表示统计学意义显著。

2.1 各组小鼠皮肤表面变化比较 Control组小鼠皮肤组织完好；
与Control组比较，Model组小鼠皮肤局部泛红，并出现白色鳞屑；
与Model组及NC组比较，不同浓度的AN处理后的小鼠局部泛红程度、白色鳞屑情况均有不同程度的改善，见图1。

图1 各组小鼠的皮肤组织变化情况

2.2 各组小鼠背部皮肤损伤比较 根据各组小鼠皮肤白光图像（图2）及UV光图像（图3），Control组小鼠皮肤无异常变化；
与Control组小鼠比较，Model组油脂分泌旺盛，存在严重的炎症反应及感染现象；
与Model组及NC组比较，不同浓度的AN处理后的小鼠皮肤受损状况均有不同程度的改善。其中，5%AN干预效果较为明显。

图2 各组小鼠的皮肤白光图像比较

图3 各组小鼠的皮肤UV光图像比较

2.3 各组小鼠皮肤指数比较 各组小鼠油份、肤色指数、色素水平、体重比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；
Model组小鼠的皮肤水份指数低于Control组，纹理指数高于Control组（P＜0.01）；
1.0%及以上浓度AN组小鼠的皮肤水份指数高于Model组，纹理指数低于Model组（P＜0.05），见图4。

图4 各组小鼠的皮肤指数

2.4 各组小鼠皮肤微生物多样性比较 α多样性分析结果显示，皮肤屏障损伤模型组小鼠的皮肤丰富度相较于正常小鼠发生一定程度的下调，但AN干预后上调，见图5；
组内β多样性分析结果显示，各组间的皮肤菌群比较，统计学意义显著（P＜0.01）；
主成分分析结果表明，Model组小鼠皮肤菌群发生显著变化，而AN干预使得皮肤屏障损伤小鼠菌群的失衡状态得到部分改善。

图5 各组小鼠皮肤菌群测序结果的α多样性分析

2.5 各组小鼠皮肤微生物组成比较八组样本的优势菌群主要为：葡萄球菌（Staphylococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、肠杆菌属（Enterobacter）、线粒体（Mitochondria）、叶绿体（Chloroplast）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）、布劳特氏菌属（Blautia）、蓝绿藻菌属（Lachnoclostridium）等10种菌群，见表1；
Model组布劳特氏菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌菌群丰度低于Control组，葡萄球菌菌群丰度高于Control组（P＜0.05）；
不同浓度AN组中布劳特氏菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌菌群丰度高于Model组，葡萄球菌菌群丰度低于Model组（P＜0.05），见图6。

图6 各组优势菌群丰度比较

表1 各组样本优势菌群比较（%）

皮肤是机体的保护屏障，可阻止病原体进入，防止物理和化学作用刺激损伤以及过多的水分流失。研究发现[4]，长时间UV照射对未受保护的皮肤屏障带来较强的损伤。较短的UVB可导致DNA损伤和炎症的发生，而较长的波长UVA可更加深入地渗透至皮肤，不仅会导致皮肤过早老化和诱发氧化应激反应，还可损伤皮肤屏障的完整性。中国药学家屠呦呦教授研制出新型抗疟疾药物青蒿素和双氢青蒿素掀起一股青蒿素及其衍生物的研究热潮，越来越多研究发现[5]，青蒿在治疗皮肤疾病中也存在广泛的应用前景。

惠海英等[4]研究发现，青蒿素对UV所致小鼠光损伤的炎症因子IL-10、TNF-α的产生有一定的抑制作用，提示系统性应用青蒿素对UVB致小鼠光损伤有保护作用。基于此，本研究通过照射UV构建皮肤屏障损伤模型，并使用不同浓度的AN干预2周，观察干预效果。结果发现，与Control组小鼠比较，Model组小鼠的皮肤局部泛红，出现白色鳞屑；
油脂分泌旺盛，存在严重的炎症反应及感染现象且皮肤水份指数减少，纹理指数增加。不同浓度的AN干预对于小鼠皮肤水份指数、纹理等问题均有不同程度的改善，其中5.0% AN组小鼠的皮肤水分指数和纹理指数等问题改善最显著，即5% AN干预效果最为明显。皮肤微生态与UV照射引起的皮肤损伤之间的密切关联研究层出不穷，Suh MG等[6]研究发现，使用胶原蛋白三肽和低聚半乳糖混合物可有效改善UVB暴露下对无毛小鼠的皮肤损害，且其嗜黏蛋白阿克曼菌属的相对丰度较对照组更高，该菌可能在UVB照射中对皮肤起到保护作用。一项通过收集暴露在UV下的皮肤样本，进一步分离DNA进行测序以确定各样本微生物组成的研究中发现，UV照射24 h后即可改变微生物组成，特别是蓝细菌门的增加，乳杆菌科和假单胞菌科的减少[7，8]。青蒿素及其衍生物通过对皮肤菌群的影响缓解皮肤相关疾病的功能作用也逐步被揭示，青蒿琥酯对痤疮丙酸杆菌具有体外抑菌的作用，余红等[9]提出青蒿素及其衍生物可通过抗真菌、抗细菌发挥治疗皮肤相关疾病的观点。此外，青蒿素衍生物双氢青蒿素可抑制UVB反复照射小鼠皮肤中c-kit和PAR-2的表达，进而对UVB照射小鼠皮肤损伤具有光保护作用[10，11]。因此，本研究进一步通过16S rRNA测序检测各组小鼠皮肤菌群的变化，结果发现与皮肤屏障损伤模型小鼠皮肤葡萄球菌菌群丰度增加，劳特氏菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌菌群丰度相对降低；
而在不同剂量AN干预后，葡萄球菌菌群丰度降低，劳特氏菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌菌群丰度相对增加。其中，葡萄球菌是革兰氏阳性球菌，多数为非致病菌，少数可导致疾病[12]。根据生化反应和产生色素不同，可分为金黄色葡萄球菌（S.aureus）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）和腐生葡萄球菌（S.saprophytics）等，其中金黄色葡萄球菌引起的慢性或急性传染病的主要原因[13]。研究发现[14]，屏障功能破坏会促进金黄色葡菌球菌的定植，而该菌可进一步延缓皮肤屏障功能的恢复。金黄色葡萄球菌可引发细胞焦亡、诱发炎症反应，从而抑制创伤的愈合作用[15]。布劳特氏菌属属于厚壁菌门，毛螺菌科，该菌具有抑制炎症进展，产生包括乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸的能力；
布劳特氏菌存在益生菌特性，可有效维持肠道稳态活性，还可抑制机体的炎症反应进展，与一些炎症性皮肤疾病的发展也密切相关[16]。嗜黏蛋白阿克曼菌是一种粘蛋白分解细菌，为革兰阴性的厌氧菌，是疣微菌门的代表。上述研究显示，AN可通过上调有益菌群丰度，下调有害菌群丰度来改善UV照射引起的皮肤屏障损伤。

综上所述，不同浓度AN可不同程度改善皮肤屏障损伤，其中5% AN的干预效果最佳。AN对皮肤屏障损伤的干预作用可能与抑制葡萄球菌，促进布劳特氏菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌有关。