顶空固相微萃取-气质联用法测定白术不同部位挥发性成分

易紫容，张睿胤，王佳玲，李可爱，张誉湘，陈淼芬，郑亚杰*，唐 其*

1湖南农业大学园艺学院，长沙 410128；
2湖南宏富农牧业发展有限公司，平江 414509

白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)，菊科苍术属多年生草本植物，以根茎入药，具健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之效[1]。现代药理学研究表明，白术具有改善胃肠功能、抗癌、保护神经等药理作用，并对免疫力低下、脑缺血、类风湿关节炎、抑郁、糖尿病等疾病具有潜在的治疗效果[2]，挥发性成分是其药理药效作用的重要组成部分[3]。其中倍半萜类化合物苍术酮(atractylon)，是白术主要药效成分之一，具有抗肿瘤、降血压、保护呼吸系统等药理作用[4]。

目前针对白术苍术酮的提取与分析主要采用水蒸气蒸馏法，存在提取效率较低、化合物易损失等缺点。顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction technology，HS-SPME-GC-MS)是一种快速简单的挥发性成分提取技术，无需经过溶剂萃取等繁琐的前处理过程[5]，具有萃取效率高、萃取时间短、样品消耗量少、挥发性化合物损失少的优势。目前已广泛应用于蔬菜、水果、酒类等样品中挥发性成分的提取[6-8]。Guo等[9]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法分离鉴定了白术中的挥发性成分，并与采用传统的水蒸气蒸馏法(steam distillation)提取的挥发性成分进行了比较，两种方法所提取出的主要组分基本一致；
Liu等[10]采用顶空液液萃取-气相色谱-质谱联用法对白术中挥发性成分进行测定，并与传统水蒸气蒸馏法提取的挥发性成分进行对比。结果表明，两种方法所提取的组分基本相同，可用于白术挥发性成分的测定。顶空固相微萃取结合气相质谱联用技术更加适合应用于白术中挥发性物质的提取。

Zhang等[11]通过比较不同产地白术苍术酮含量，发现产自湖南平江的白术苍术酮含量较多。目前，对白术中苍术酮的研究与开发主要集中在其主根部位中，对于白术其它非药用部位的相关研究较少，因此本实验首次以平江白术主根、须根、茎、叶四个部位为原料，采用HS-SPME-GC-MS技术分析白术四个部位苍术酮成分含量差异，并比较其不同部位的挥发性成分组成差异，为白术非药用部位挥发性成分的研究及开发利用提供参考。

1.1 仪器

GCMS-QP2010 型气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)，配有GC/MS solution色谱工作站和NIST.14、NIST.17质谱数据库；
HP-88(100 m×0.25 mm，0.20 μm，安捷伦公司)固相微萃取装置(上海安谱实验科技股份有限公司)，包括萃取纤维针头(65 μm-PDMS/DVB、50/30 μm-DVB/Carboxen-PDMS)、固相微萃取手动进样手柄、顶空样品瓶；
YB-1500A 型粉碎机(永康市速锋工贸有限公司)；
PL203 电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；
MM400混合型球磨仪(广州艾威仪器科技有限公司)；
Milli-Q Advantage A10 超纯水制备系统(美国MILLPORE公司)。

1.2 实验样品

实验用白术样品于2020年11月10日在湖南省岳阳市平江县湖南宏富农牧业发展有限公司白术种植基地采集，选择3个基地，每个基地采样20株，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)，按部位分为白术的主根(AM-MR)、须根(AM-FR)、茎(AM-S)、叶(AM-L)。对照品苍术酮(普思生物科技有限公司(成都)，纯度≥98%)。

1.3 方法

1.3.1 材料准备及样品前处理

将白术放置60 ℃的烘干机中烘干至恒重，使用球磨仪使其粉碎，置于封口袋编号封口保存，备用。精密称定0.5 g样品，放置顶空样品瓶中。

等比例称取白术不同部位样品，并均匀混合，精密称定0.5 g，放置顶空进样瓶中，用作质量控制样品。

将对照品使用正己烷稀释，苍术酮浓度为1.0 mg/mL；
吸取稀释后的对照品溶液1 μL于顶空样品瓶中，拧紧瓶盖，备用。

1.3.2 萃取头纤维老化

组装萃取进样手柄与萃取纤维针头，随后插入气相色谱仪的气化室SPL1处并推出萃取纤维针头，设定气化室温度为240 ℃，40 min后缩回萃取纤维针头，取出萃取进样手柄，完成纤维头老化。

1.3.3 萃取方法

固相微萃取装置设定温度为70 ℃，将装有样品的萃取瓶固定在装置中预热40 min，再将萃取进样手柄插入萃取瓶并推出萃取纤维针头，40 min后缩回萃取针头，取出萃取手柄，迅速插入GC进样器中。

1.3.4 质量控制

实验开始前进行空载、空针、空瓶等空白实验；
正式实验开始前、结束后插入质量控制样品，实验方法同上；
实验样品每组3个重复。

1.3.5 GC-MS测试条件

色谱条件：色谱柱为HP-88(100 m × 0.25 mm，0.20 μm)；
进样口温度240 ℃；
载气高纯氦气(含有量99.99%)；
柱流量为1.37 mL/min；
分流比5∶1；
程序升温：初始柱温60 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升到140 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升到210 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升到210 ℃，保持10 min，最后以5 ℃/min升到240 ℃，保持10 min。

接口温度：220 ℃；
离子源：EI源；
离子源温度：200 ℃，电子能量：70 eV；
溶剂延迟：9.5 min；
检测器电压：0.9 kV；
质荷比扫描范围：50～600m/z。

2.1 萃取纤维头的优化

不同颜色的固相微萃取纤维头代表了不同的吸附膜种类，对挥发性成分的吸附能力存在较大差异。通过比较50/30 μm-DVB/Carboxen-PDMS、65 μm-PDMS/DVB(分别编号为1和2)两种萃取纤维头与对白术主根、须根、茎、叶混合样品中苍术酮的吸附能力，筛选出适合白术混合样品中挥发性成分的萃取纤维头。通过实验对比，发现65 μm-PDMS/DVB萃取纤维头对苍术酮的萃取效果要强于50/30 μm-DVB/Carboxen-PDMS萃取纤维头(见图1)，因此本研究选取65 μm-PDMS/DVB纤维头用于后续实验。

图1 不同萃取头对苍术酮吸附效果影响

2.2 挥发性成分分析

对白术不同部位(主根、须根、茎、叶)挥发性成分进行测定(见图2)，经NIST.14、NIST.14s、NIST.17-1、NIST.17-2等质谱数据库检索，并通过查阅相关文献、与标准图谱对照分析标准品比对等方法，使用面积归一法计算各个积分的色谱峰占总峰面积的百分比，得到白术不同部位不同化合物相对百分比含量(见表1)。统计分析采用SPSS 26.0软件，包括方差分析采用单因素ANOVA法，多重比较采用Duncan′s法。

图2 白术不同部位挥发性成分GC-MS TIC图

对白术不同部位(主根、须根、茎、叶)干燥样品中挥发性成分含量进行测定并分析其主要挥发性化合物在不同部位中的差异。白术四个部位共鉴定出70种化合物(见表1)，包括萜类(52种)、酯类(4种)、醛类(4种)、萘类(4种)、酮类(3种)化合物等，且不同部位挥发性成分的组成与含量差异较大(见图3、4)。其中共有成分有14种；
主根中特有成分有2种；
须根中特有成分有11种；
叶中特有成分有23种，相对较多；
主要以萜烯类、萜烯醇类化合物为主。从主根部位共鉴定27种挥发性成分，苍术酮(37.79%)为主要成分；
须根部位共鉴定35种挥发性成分，主要为苍术酮(25.85%)、β-倍半水芹烯(11.68%)、瓦伦亚烯(9.47%)、γ-榄香烯(6.47%)等；
茎中鉴定32种挥发性成分，β-倍半水芹烯(12.09%)、苍术酮(11.54%)含量相对较高；
叶中共鉴定45种，主要成分为右旋大根香叶烯(18.74%)、D-柠檬烯(12.89%)、γ-依兰油烯(8.56%)、石竹烯(6.65%)、苍术酮(5.98%)等。

图3 不同部位白术挥发性成分组成

图4 不同部位白术挥发性成分Venn图

主成分分析法通过降维、变量提取与压缩数据来确定中药资源的分类和聚类，并从中获取能用于中药分析鉴别的重要信息[12]，在中药质量研究上发挥着重要作用。本研究将测定的白术四个部位(主根、须根、茎、叶)挥发性化合物含量数据处理后进行主成分分析，共提取到五个主成分，其中第一主成分占比71.6%，第二主成分占比15%，故选取主成分一、二基本能涵盖样品的大部分成分信息。如图5所示，明显看出各样品组间呈现出很好的聚集趋势，组内重复可以很好地聚集在一起，且组间出现明显分离；
不同部位白术样品存在明显的组间差异，表明不同部位白术挥发性化学成分具有显著变化。其中白术主根、须根样品为一大组，茎样品为一大组，叶样品为一大组，不同部位挥发性成分组成差异明显；
结合表1、图3发现白术叶中萜烯类、萜烯醇类化合物种类、含量均高于其他部位，推测其原因主要为植物不同部位生理生化功能、生长环境等差异；
Zhu等[13]研究药用部位根茎中的挥发性成分时发现光照强度、温度等因素对挥发性成分稳定性均有影响，光照强度是影响挥发性成分稳定性的主要因素；
白术叶、茎作为白术的地上部分，其受到的光强和温度均高于作为地下部分的白术主根、须根，因此不同部位挥发性成分的组成、含量产生显著差异的原因可能也与光照强度、温度等因素有关。部分萜类化合物在植物的自身防御与繁衍后代方面发挥重要作用[14]，如Yang等[15]在研究白术挥发油积累因素时表明，在植物防御过程中，白术体内倍半萜类化合物的合成很可能受转录因子的调控，以应对虫害等胁迫。大根香叶烯D[16]和D-柠檬烯[17]等对昆虫均有引诱作用，可能会对咬食白术叶昆虫的天敌昆虫及帮助白术花传粉的昆虫具有一定的吸引作用。

根据图5的结果，绘制了白术不同部位挥发性成分聚类热图(见图6)，通过聚类算法，发现白术主根与须根具有较高相关性，白术叶与其他部位则具有显著差异，这与主成分分析结果一致。挥发性成分含量累积差异也具有鲜明特征，主要体现在白术叶与白术主根、须根之间。白术不同部位挥发性成分累积模式可大致分为两大模块，第一模块主要在白术叶中显著累积，如D-柠檬烯、芳樟醇等；
第二模块则主要在白术须根、主根中显著累积，如苍术酮等。另外对挥发性成分累积情况进行分析，发现白术茎中挥发性成分累积模式较特殊，局部覆盖两大模块，推测可能与其在植物中负责物质交流与运输的生理学功能有关。

图5 白术不同部位挥发性成分PCA得分图

图6 白术不同部位挥发性成分热图

实验发现，白术不同部位中挥发性成分积累具有较大差异。苍术酮(见图7)作为白术主要药效成分，主要在白术根部累积，具有抗肿瘤、降血压、保护呼吸系统、抗炎、镇痛、抗氧化、保肝、抗流感病毒、除螨等广泛良好的药理活性；
本研究发现，除白术传统入药部位主根、茎外，其须根(25.85%)、叶(5.98%)中苍术酮相对含量亦有较高水平；
采收季白术茎叶占整株比例40%，主根占比40%，须根超过占比10%，然而茎、叶等部位多作废弃物处理，具有较大开发利用潜力；
Shao等[18]通过研究白术主根与须根的质量差异得出，在以白术挥发性成分为主要药效成分时，白术须根可考虑代替主根入药；
苍术酮作为市场需求广泛的药效成分，相关质量控制研究相对较少，并因提取技术、产量等因素一直制约了大规模的开发和利用，本研究可为其提取利用提供新的思路。苍术酮极不稳定，在常温下易与水发生氧化反应，生成白术内脂I、III等化合物[19]。但在本实验中四个部位均未发现白术内脂及相关化合物，其原因推测为挥发性成分萃取过程选用顶空固相微萃取法，避免了溶剂、高温等其他的因素的干扰，且萃取时间较短。结合本实验来看，顶空固相微萃取结合气质联用技术具有高效、微量、灵敏等特点，能够更好地反映药材本身挥发性成分组成、累积情况，目前在对植物源挥发性成分检测分析的领域使用已十分广泛,如枳壳、黄花菜等[20,21]，可为苍术酮等植物源挥发性成分的检测分析、生物合成途径解析等相关研究提供技术选择与参考。

图7 苍术酮化学结构(左)及3D模型(右)

其次，发现白术叶中挥发性成分种类、相对含量相较于其他三者具有显著差异；
叶中共测定45种挥发性化合物，萜烯类化合物是白术叶中主要的挥发油成分。其中大根香叶烯D的相对含量最高(18.74%)，已被证明是黄花蒿、白花丹参等植物的关键抗菌活性成分[22,23]，被应用于艾草精油等相关产品的制作；
同时大根香叶烯D对害虫、病菌等具有很强的吸引作用，可作为趋避剂的天然先导物[16]。D-柠檬烯是一种天然功能性单萜烯，在白术叶中有较高相对含量(12.89%)，具有显著的抗肿瘤、抑菌消炎的活性[24]；
此外，在食品领域，D-柠檬烯因其增香和抗氧化的特性常用于食品添加剂[25]；
在农药方面，D-柠檬烯对某些昆虫具有引诱作用，还能抑制部分杂草的生长[26]，因而可应用于天然抗虫、除草剂。综上所述，白术叶、茎等部位在天然产物开发与利用领域具有良好前景。

当前，白术市场需求较大，而对白术挥发性成分的研究几乎都集中在其药用部位根、茎，对于其叶、须根等非药用部位研究开发相对较少，如白术叶等部位仅当作废弃物处理，若能对白术非药用部位进行进一步的研究与开发，将提高资源利用率，缓解资源紧缺问题。本次实验运用顶空固相微萃取-气质联用技术(HS-SPME-GC-MS)测定白术不同部位中挥发性成分，阐明其不同部位间挥发性成分组成差异，为白术非药用部位挥发性成分的开发利用提供了数据基础；
传统检测方法中苍术酮存有易转化等问题，本研究可为白术等相关药材的质量检测控制提供技术参考。