油茶籽油加工过程中蛋白含量的变化研究

刘本同，秦玉川，王丽玲，黄旭波，童晓青，方 茹， 贺 亮，程俊文，王衍彬，杨 柳

(浙江省林业科学研究院森林食品所,杭州 310023)

油茶属山茶科油茶属植物，是中国传统的木本油料作物之一，也是我国大力发展的山地木本食用油原料，截止2020年，国内栽培面积突破7 000万亩。从油茶种子中获取的油茶籽油，因其产地环保、脂肪酸组成合理、富含健康因子等优点而备爱关注，逐渐成为消费级高端木本食用油的代表，2020年全国油茶籽油产量突破80万t，产值超过1 000亿元，成为中国食用油的重要组成之一。

蛋白广泛存在于油料植物种子中，也是油体膜层的主要组成部分[1]，在食用油的生产过程中，部分蛋白质会在压榨、浸提等加工过程中因压力等原因被带入到油脂中，但因为油脂中蛋白含量一般非常微量而未受重视，通常认为油脂中的少量蛋白会在脱胶等精炼过程中除去[2]。但也有研究表明，精炼工艺并不能完全消除蛋白组分[3]，植物油中的微量蛋白质不仅会对油脂贮存稳定性造成影响[4]，还可能会引起一些不良过敏反应[5]

压榨与浸提是常用的食用油制取工艺，压榨工艺制取的油茶籽油感官品质、理化指标与储藏品质较优，但出油率较浸提工艺低；
浸提工艺出油率高[6]，但油的感官品质和耐贮性等指标较压榨油差，并可能存在溶剂残留与苯并(α)芘超标的风险[7]。由于市场上压榨与浸提油茶籽油价格差异较大，在实际生产中，浸提油茶籽油一般由压榨饼粕浸提所得，原料贮藏条件无法控制，更是加大了产品中苯并(α)芘、塑化剂、黄曲霉毒素污染的风险[8-10]。

对油茶籽油是否为浸提的判断，一般是根据GB 5009.262—2016《食品中溶剂残留量》进行溶剂残留检测，经样品准备、顶空平衡、气相色谱分析，每个样品耗时超过1 h。而且，检出限仅为2 mg/kg，现有的高真空脱臭技术可以较容易地达到这一目标。巨大的经济利益与油脂脱溶剂技术的进步，导致市场上使用或添加浸提油茶籽油冒充压榨油茶籽油的现象层出不穷。

离子液体-盐离子组成的双水相体系(ABS)是近年来发展起来的一种新型分离纯化技术[11-13]，双水相体系在生物大分子的分离和提取方面具有独特的优势[12, 14]，而离子液体与双水相体系作为环境友好型萃取体系的优势相得益彰，并能有效地解决传统聚合物-聚合物或聚合物-盐双水相体系极性不可调造成萃取效率低下的问题[13]。目前离子液体-盐双水相体系在提取蛋白方面得到了广泛的应用。Belchior等[14]利用生物相容性的四烷基类离子液体与K2HPO4/KH2PO4/K3PO4组成的双水相体系成功萃取了卵清蛋白和溶菌酶，并进一步从离子液体富集相中回收了蛋白，回收率达到99%。Han等[15]利用金属螯合离子液体双水相浮选体系并结合两步沉淀法从菠萝中成功提取了菠萝蛋白酶。离子液体具有几乎不挥发、不可燃、溶解性能优异、结构可设计等特点[16, 17]，因此与传统蛋白提取方法相比，离子液体-盐双水相体系提取蛋白具有环境友好、体系温和等优点。

本研究针对油茶籽油精制的过程，考察过滤、脱胶、碱炼、脱色、脱臭、冬化等工艺过程中所得到的食用油，借助咪唑类离子液体-碳酸钾双水相萃取法获得油中的残留蛋白，分析蛋白含量及性质的变化，探明蛋白含量变化与油脂加工过程的相关性，为加工技术改进提供思路，并探讨了利用油中蛋白含量作为鉴别压榨与浸提油茶籽油方法的可行性。

1.1 材料与仪器

油茶籽、BCA蛋白检测试剂盒、[Bmim]Cl；
磷酸钾、氢氧化钠、氯化钠：分析纯；
白土、硅酸镁：食品级。

Lab Dancer振荡器，Multiskan酶标仪，ZS90粒度分析仪，SSYZ30A双螺杆压榨机。

1.2 方法

1.2.1 油茶籽油处理方法

压榨方法：油茶籽干燥至含水率6%～8%，脱壳粉碎，输送至双螺杆压榨机压榨，压榨油过60目滤袋初滤，为压榨油；

过滤方法：压榨油过200目滤袋精滤；

精炼方法：压榨过滤后的油茶籽毛油经水化脱胶、碱炼、水洗、脱色、脱臭、冬化，制得成品油茶籽油(图1)，具体工艺参数为：

脱胶油制备：过滤毛油搅拌升温至75 ℃，缓慢加入同温油质量0.8%～1.2%的纯净水，45 r/min搅拌15 min，静置分离，得到脱胶油。

碱炼脱酸：将脱胶油加热至80 ℃，加入玻美度4°同温碱液，60 r/min搅拌50 min，再降至30 r/min搅拌15 min，搅拌过程中升温至95 ℃。静置分层，获得碱炼油；
碱炼油加入同温油质量10%的1.5%氯化钠水溶液，搅拌洗涤，静置分层，获得水洗1次油；
同样方法重复水洗1遍，获得水洗2遍油。

吸附脱色：将碱炼脱酸水洗2遍后的油，加入1.5%的白土和0.5%的硅酸镁，搅拌加温至95 ℃，继续搅拌30 min，真空过滤，获得脱色油。

真空脱臭：将脱色油加入脱臭罐中，于180 ℃，1.0 kPa真空度下脱臭30 min，降温，获得脱臭油。

冬化：将脱臭油，降温至40 ℃左右，加入到冬化罐中，10～15 r/min搅拌，分级冷却至4～6 ℃，养晶72 h，0.35 MPa过滤，获得成品油。

图1 油茶籽油精制工艺简化图

1.2.2 离子液体双水相体系相图测定

采用浊点法测定25 ℃条件下离子液体双水相体系的相图。首先称取一定量的离子液体溶于0.5 g水中，加入一定量的盐至体系浑浊，精确记录加入的盐和离子液体质量，向混合液中滴加纯净水至体系澄清，精确记录加入水的量，随后加入一定量的盐至体系再次浑浊，精确记录加入的盐的质量，重复滴加纯净水及盐的步骤，直至收集足够数据。

1.2.3 双水相提取油茶籽油蛋白

将一定量的油茶籽油加入到离子液体和盐形成的双水相中。以离子液体和盐的浓度为研究对象，通过式(1)计算提取效率。

(1)

1.2.4 蛋白测定方法

采用BCA法测定蛋白质含量，测定方法参照BCA检测试剂盒的使用说明。以牛血清白蛋白溶液为对照，绘制标准曲线。

1.2.5 油中非脂溶性颗粒测定方法

精确称取油茶籽油样品1.00 g加入到10 mL玻璃具塞试管中，加入2.0 mL高纯水，振荡1 min，静置分层，弃去油相，再向试管中加入2 mL色谱纯正己烷，振荡30 s，静置分层，弃去有机相，留水相备用。

吸取1.2 mL水相加入Zeta粒度电位仪样品杯中进行粒径测试。测试条件：粒径模式，物料：蛋白，分散介质：水；
温度：25 ℃，平衡时间：120 s，测定次数：100次。

1.2.6 磷脂含量分析

按GB/T 5537—2008《粮油检验 磷脂含量的测定 第二法 质量法》测定。

1.2.7 数据分析

数据统计与制图采用WPS2019和Python3.9。

2.1 [Bmin]Cl-K2CO3相图绘制及浓度实验

在目标成分的分离应用中，对双水相的要求不仅要易形成，而且要有理想的提取效率。根据以往的研究，离子液体的提取性能取决于其对目标化合物的溶解能力，同时也可能受到离子液体本身或与被提取物结合产生的聚类现象的影响[18]，因此根据文献中离子液体-盐双水相体系形成的特点[19,20]，本实验选择易于形成双水相且对蛋白提取有良好效率的咪唑类离子液体[Bmin]Cl和碳酸钾。由于双水相体系不像普通的液液萃取体系可通过将预平衡后的两相直接混合获得较为合适的两相比，需要根据具体分相情况判断。因此为了探明两者形成双水相的浓度范围，采用浊点法测定25 ℃条件下离子液体双水相体系的相图(图2)，以形成的相曲线为分界，上方为两相区，下方为均相区，并据此确定萃取体系的配比，并考察离子液体和盐的浓度对提取效率的影响(图3)确定用于后续油茶籽油蛋白的提取的[Bmin]Cl和碳酸钾质量浓度分别为200、500 g/L。

图2 25 ℃常压下[Bmin]Cl + K2CO3+H2O形成双水相图

图3 盐浓度和IL浓度对蛋白提取性能的影响

2.2 蛋白含量测试方法学结果

图4为油中蛋白测试方法，标准样品测试结果与线性拟合结果，拟合方程为：y=0.7283+0.15198x，方程R2=0.985 74。同一样品分成6组，采用1.2方法进行重复性和加标回收率试验，结果表明，样品蛋白质量分数平均值为(0.212 0±0.009 3)%，变异系数为4.39%，平均加标回收率为(80.95±0.05)%，说明本方法稳定性和精度较好，可以满足研究需求。

图4 油中蛋白含量测试标准样品线性拟合

2.3 油茶籽油加工过程中蛋白含量的变化

图5为油茶籽油从压榨后的毛油，经过滤、脱胶、碱炼、脱色、脱臭、冬化等工艺制成成品油过程中，各工序油中蛋白含量的结果。t检验结果表明，过滤、脱胶、碱炼、脱色、冬化工艺均会明显降低油中蛋白质的含量，处理前后蛋白含量差异极显著，特别是压榨毛油的过滤程序，油中蛋白降低了76.03%，降幅最大，其次为碱炼工艺和脱色工艺，油中蛋白质量分数分别降低了38.29%和31.41%，在毛油阶段，蛋白、磷脂和碳水化合物等杂质含量较高，易于凝聚成团，200目滤袋可以有效的将包括蛋白在内的大部分杂质滤除，碱炼中添加碱水反应后的油水分离，脱色工艺中添加的多孔性助滤剂，均能有效降低蛋白等杂质的含量，油脂精炼工艺中蛋白含量的减少在大豆油精炼过程的中也得到了证实[21]。在精炼工艺中，碱炼后的水洗步骤、脱臭工艺对油中蛋白含量的影响较小，加工前后含量数据无显著性差异。

注：*表示差异显著性，P<0.01。图5 不同工序油茶籽油蛋白含量

2.4 油茶籽油加工过程中非脂溶性颗粒物的变化

从图6可以看出，在油茶籽油加工过程中，非脂溶性的颗粒物粒径是逐渐变小的，这与油中蛋白质含量的变化趋势是一致的，但油茶籽油中的颗粒物并非只有蛋白一种，还含有磷脂、淀粉与纤维等杂质。图7展示了加工过程中蛋白含量、磷脂含量与非脂溶性颗粒物粒径的变化，通过Pearson相关性分析发现，蛋白含量、磷脂含量与粒径间呈极强的正相关性，相关系数分别为0.904 7和0.981 4(P<0.01)。

研究表明，含油种子中的油体为球形，内部为甘油三酯液滴，外层包裹了由磷脂和蛋白组成的膜[22]，油茶籽油体中发现8种蛋白，分子质量范围在13～54 ku之间[23],以14.4、18.4 ku 2种蛋白为主[24]。油料种子在压榨过程中，种仁破碎，种仁中的蛋白与油体膜中的蛋白和磷脂随甘油三酯流出，在毛油阶段，由于蛋白、磷脂等杂质和水分含量较高，这些杂质容易聚集成团，形成大颗粒，随着脱胶、碱炼、水洗、脱色等精炼工艺的进行，颗粒性杂质大幅降低，其聚集速度变慢，这可能是所测非水溶性颗粒物尺寸随精炼工艺的进行逐渐变小的原因之一。

图6 油茶籽油加工过程中非脂溶性 颗粒物颗粒变化

图7 油茶籽油加工过程中非脂溶性颗粒 大小、蛋白、磷脂含量变化图

2.5 压榨与浸提成品油茶籽油中蛋白含量的差异

本研究共收集到压榨成品油茶籽油样本16个，其中企业采样6个，市场采购7个，实验室自制3个，浸提成品油茶籽油样本14个，其中企业采样4个，市场采购7个，实验室自制3个。30个样本中蛋白含量结果见图8。

图8 压榨与浸提成品油中蛋白含量差异

从图8可以看出，压榨成品油茶籽油中蛋白含量明显高于浸提成品油茶籽油，压榨油中蛋白含量范围0.070 4～0.584 2 mg/g，浸提油中蛋白含量范围0.000 1～0.058 2 mg/g，t检验结果表明，在0.01水平，两组数据间存在极显著性差异，表明压榨成品油和浸提成品油中蛋白含量差异巨大。浸提法制油是利用相似相溶的原理将种子中的甘油三酯利用低极性有机溶剂从原料中溶解出来的方法，浸提成品油中蛋白含量较低，可能与种子中的蛋白在溶剂中的溶解性较差，以及浸提油基本上采用压榨剩余饼粕做为溶剂浸提原料有关。油茶籽饼粕原料采购自不同地区不同压榨企业，储存环境各异，江南的多雨气候导致原料含水率升高，微生物繁殖，残油的水解和氧化现象严重。浸提原料的品质不高，且差异较大，使得浸提毛油品质差异巨大，不得不采用重度精炼工艺使其满足食用植物油的卫生标准要求，这也导致了浸提成品油中微量蛋白的含量远低于压榨成品油。

鉴于市场上油茶籽油产品鱼龙混杂，国标对浸提油鉴定的局限性，采用本研究方法进行油茶籽油中的蛋白含量测定，方法简单快速，样本量少，成本低，且采用酶标仪和96孔板单次可同时分析80个以上样本，可以用于压榨与浸提油茶籽油的初步筛检。

在油料作物种子中，蛋白、磷脂和甘油三酯组成了油体，制油过程，伴随着油体的破碎，必然会有少量蛋白和磷脂随着加工过程被带入食用油中，影响着油脂的感观、气味、储存性和加工特性等，部分食用油中的蛋白还可能带来过敏风险。油脂加工的精炼过程，也是磷脂与蛋白等“不良”因子去除的过程。食用油中的蛋白质含量较少，提取与分析困难，本研究采用[Bmin]Cl+K2CO3双水相体系对油茶籽油中的蛋白进行提取、分析，方法重复测试变异系数4.39%，平均加标回收率为(80.95±0.05)%，是一种可行的油脂蛋白含量测定方法。

利用本方法对油茶籽油加工过程研究发现，压榨油茶籽油中蛋白含量可达2.0 mg/g以上，随着过滤、脱胶、碱炼、脱色等加工工艺的进行，成品油中蛋白含量可降至0.2 mg/g以下，部分样品低到0.000 1 mg/g。在这些加工过程中，过滤、脱胶、碱炼、脱色、冬化工序均能显著降低油中蛋白含量，其中过滤工序最为明显，蛋白含量减少76.03%。

通过对压榨与浸提成品油茶籽油中的蛋白含量研究发现，浸提成品油茶籽油中的蛋白含量明显低于压榨成品油茶籽油，并具有极显著差异。因原料与加工工艺的不同，市场上的压榨油茶籽油与浸提油茶籽油价格至少差了一倍，这也导致了现在市场出现采用浸提油茶籽油冒充压榨油的现象。本实验采用的油脂中蛋白含量检测方法，在效率和精度上，能够满足检测的需求，利用蛋白含量对压榨和浸提油茶籽油进行鉴别，具有极大的实际应用潜力。

本实验采用双水相萃取技术研究油茶籽油中的蛋白，获得油中的微量蛋白双水相萃取体系，方法回归决定系数R2=0.985 74，变异系数4.39%，加标回收率(80.95±0.05)%，是一种快速可行的油脂蛋白检测方法，本实验成品油中蛋白含量仅为压榨毛油的3.32%。虽然油中蛋白含量受加工工序的影响较大，但相比于油中残留溶剂的顶空-气相色谱法，其低检出限与快速、批量检测能力等优点，使得利用油中蛋白含量作为压榨与浸提油的鉴别指标成为可能。