凯氏定氮法测定面粉中蛋白质的不确定度评定

樊永华

（永城职业学院，河南永城 476600）

面粉中蛋白质含量的高低，既是判断面粉营养价值的一项重要指标，也是影响面粉使用功能、食品品质及市场价值的重要因素。因此，检测面粉中蛋白质含量工作十分重要，但在检测的实际操作过程中，会存在一定的不确定度，致使测定结果产生误差[1-4]。

GB 5009.5—2016 《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[5]中有凯氏定氮法、分光光度法和燃烧法3 种测定蛋白质含量的方法，本研究采用的是凯氏定氮法。本试验基于JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[6]技术规范的要求，依据凯氏定氮法的标准方法，通过建立数学模型，对影响面粉中的蛋白质含量检测的不确定度因素进行测定和分析，以期能提高面粉中蛋白质含量检测的质量，获得更可靠、更真实的检测数据。

1.1 材料与试剂

面粉为市售样品。

浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、硼酸、氢氧化钠、甲基红、溴甲酚绿、95%乙醇、浓盐酸、无水碳酸钠等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

分析天平（0.1 mg）、分析天平（0.01 mg）、马弗炉、凯氏定氮蒸馏装置。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

依据国标GB 5009.5—2016 第一法凯氏定氮法进行样品处理。称取面粉1.5 g（精确到0.001 g）放入250 mL 定氮瓶中，加入催化剂（0.4 g 硫酸铜、6 g 硫酸钾）及20 mL 硫酸，小火加热至泡沫停止，加大火力使液体保持微沸状态，至蓝绿色透明后，再继续加热0.5～1 h。放冷后，转移定容至100 mL 容量瓶中。吸取10 mL 消化液用凯氏定氮蒸馏装置进行蒸馏，最后用0.100 0 mol/L 盐酸标准溶液进行滴定。同时做空白试验。

1.3.2 建立数学模型

蛋白质的含量主要是根据滴定消耗的0.100 0 mol/L 的盐酸标准溶液的体积进行氮含量的计算，然后乘以蛋白质换算系数，求出蛋白质的含量，其计算公式如下：

式中：

m——面粉的质量，g；

V1——滴定样品消耗盐酸标准溶液的体积，mL；

V2 ——空白试验消耗盐酸标准溶液的体积，mL；

C——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；

V3——吸取消化液的体积，mL；

0.014 0——1.000 mol/L 盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量，g；

5.70——面粉中的氮换算为蛋白质的系数。

1.3.3 凯氏定氮法测定面粉蛋白质含量的不确定来源分析

本试验采用的是国标中的测定方法，实验室也经过了严格的检定程序，认证合格。因此，对测试方法的影响不再考虑，对温度、湿度等实验室环境条件对试验结果的影响也可忽略不计[7]。

根据试验操作的具体步骤以及所建立的数学模型，将凯氏定氮法测定面粉中蛋白质含量的不确定来源归纳如表1 所示[8-15]。

表1 凯氏定氮法测定面粉蛋白质含量的不确定度来源和评定方法

2.1 盐酸标准滴定溶液引入的不确定度

2.1.1 标定盐酸标准溶液浓度建立的数学模型[16]

式中：

CHCl——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；

m——基准物质无水碳酸钠的质量，g；

V1——基准样品消耗的盐酸标准溶液的体积，mL；

V2——空白实验消耗的盐酸标准溶液的体积，mL；

M——无水碳酸钠的摩尔质量的数值［M（1/2NaCO3）=52.994］。

2.1.2 盐酸标准滴定溶液引入的不确定度u1（1）标定重复性引入的A 类不确定度u11

采用2 人4 平行，共做了8 次对0.1 mol/L 盐酸标准溶液的标定实验，实验结果记录见表2。

由表2 可知，盐酸标准溶液浓度的平均值为0.100 3 mol/L，根据贝塞尔公式，可知其标准差为：

表2 0.100 0 mol/L 盐酸标准溶液标定记录表

相对标准不确定度为ur11=1.31×10-4÷0.100 3=1.31×10-3

（2）基准物质无水碳酸钠的纯度引入的不确定度u12

购买的基准物质无水碳酸钠，其证书上标注的不确定度为0.06%，P=0.95，查表得k=1.960，则相对标准不确定度ur12=0.000 6/1.960/1=3.06×10-4

（3）基准物质无水碳酸钠的称量引入的不确定度u13

由电子分析天平鉴定证书可知，电子分析天平的最大允许误差为±0.000 1 g，假设均匀分布，查表得，称样量约为0.20 g，则标准不确定度u13=相对标准不确定度ur13=0.000 057 7÷0.2=2.89×10-4

（4）标定时消耗的盐酸体积引入的不确定度u14

本实验采用50 mL 酸式滴定管进行盐酸标准溶液的滴定操作。滴定消耗体积引入的不确定度有3 个方面的来源：

①滴定管的容量引入的不确定度。50 mL 的酸式滴定管的容量允许差为±0.05 mL，假设均匀分布，查表得则标准不确定度=0.029 mL

②滴定管读数引入的不确定度。50mL 的酸式滴定管的最小刻度是0.1 mL，小数点第2 位是估读数字，估读的误差为±0.02 mL，假设均匀分布，查表得，消耗的体积需要2 次读数，则标准不确定度

③温度变化引入的液体体积不确定度。滴定管的体积是以20 ℃水的体积为基准确定的。实验在空调控制的条件下进行，室内温度基本恒定在20 ℃，由于温度的波动引起的滴定管体积的变化极小，对实验结果的影响可以忽略不计。

因温度变化引起的液体体积的不确定度不再列入考虑的范畴。因此可将滴定管的容量、读数引入的不确定度进行合并，得出由标定盐酸标准溶液时消耗的盐酸体积引入的不确定度

相对不确定度ur14=0.037 6/37.66=9.98×10-4

以上所分析的盐酸标准滴定溶液不确定度各分量之间不相关性，即相互独立，所以其合成相对标准不确定度为：

2.2 面粉的质量称量引入的不确定度u2

由电子分析天平鉴定证书可知，电子分析天平的最大允许误差为±0.000 4 g，假设均匀分布，查表得称样量均值为1.519 8 g，则标准不确定度为

u2=0.000，相对标准不确定度ur2=0.000 231/1.519 8=1.52×10-4

2.3 消化液定容时，由定容的体积引入的不确定度u3

定容时，引入的不确定度有三个方面的来源：（1）容量瓶的容积。100 mL 容量瓶的允许误差为±0.10 mL，按照均匀分布考虑，查表得，则标准不确定度

（2）估读误差。定容时估读误差约为±0.04 mL，按照均匀分布考虑，得，则标准不确定度

（3）温度系数引起的不确定度。容量瓶校准的温度为20℃，实验室的温度基本恒定在20℃，因而由于温度的波动导致的液体体积的变化非常小，对实验结果的影响可以忽略不计，故温度的影响不再考虑在内。

因此，消化液定容时，由于定容的体积引入的相对不确定度

2.4 吸取消化液进行蒸馏时，由取样的体积引入的不确定度u4

进行吸取10.0 mL 的消化液进行蒸馏这一操作步骤，带来的不确定度主要是以下几个方面：

（1）移液管的容积。实验使用的是10 mL 的单标线移液管（A 级），容量的误差范围为±0.020 mL，按照均匀分布考虑，则有标准不确定度

（2）读数误差。移液管的估读误差约为±0.02 mL，按照均匀分布考虑，则有标准不确定度u42=

（3）温度系数引起的不确定度。移液管的校准温度为20 ℃，实验室的温度基本恒定在20 ℃，因温度引入的不确定度不再考虑之内。因此，移取消化液，由于取样的体积引入的相对不确定度ur4=

2.5 测定样品时，消耗盐酸标准溶液引入的不确定度u5

消耗盐酸标准溶液的不确定来源有：

（1）滴定管的容量。本实验使用的是5 mL 的微量滴定管，容量允差为±0.010 mL，按照均匀分布考虑则有标准不确定度0.005 77 mL

（2）读数误差。滴定管的最小分度值0.02 mL，读数估读误差约为±0.01 mL，按照均匀分布考虑，k=，滴定消耗的体积需要2 次读数，则有标准不确定度

（3）温度。忽略不计。

因此，滴定管引入的相对标准不确定度ur5=

2.6 面粉蛋白质重复性测定引入的不确定度u6

对面粉样品进行10 次平行测定，面粉中蛋白质含量的测定结果见表3。

表3 面粉中蛋白质含量测定记录表

由表3 可知，面粉中蛋白质含量的平均值（x）为12.51 g/100 g，根据贝塞尔公式，可知其标准差为：=0.055 8 mol/L

2.7 数值修约引入的不确定度u7

国标中规定，蛋白质含量≥1g/100 g 时，结果保留3 位有效数字。结果修约采用四舍五入的方式。修约引入的不确定度是B 类不确定度。a=0.05，按照均匀分布考虑，则标准不确定度=0.029 g/100 g，相对标准不确定度ur7=0.029/12.51=2.32×10-3

2.8 水和试剂引入的不确定度

水和试剂引入的不确定度，可以通过空白实验消除，对实验结果不确定度的影响，可以忽略不计。

2.9 评定合成相对标准不确定度uc

综上所述，测定面粉蛋白质含量的不确定度来源及数值见表4。其中，盐酸滴定样品过程中引入的体积不确定度、数据修约引入的不确定度、取样、重复性测定以及标定盐酸标准溶液引入的不确定度是引入蛋白质含量数值不确定度的主要来源。以上的各相对标准确定度互不相关的，其合成相对标准不确定度ur=

表4 各个不确定度分量来源及数值统计

2.10 确定扩展不确定度U 及结果报告

面粉中蛋白质含量的平均值（x）为12.51 g/100 g，其合成标准不确定度为：uc=ur× x=6.41×10-4×12.51=8.02×10-3

取包含因子k=2，扩展不确定度U=u×k=8.02×10-3×2=0.016 g/100 g

本试验分析了凯氏定氮法测定面粉中蛋白质含量不确定来源，并对测定过程可能引入的不确定因素进行了分析和评定。结果表明，盐酸滴定样品过程中引入的体积不确定度、数据修约引入的不确定度、取样、重复性测定以及标定盐酸标准溶液引入的不确定度是引入面粉蛋白质测量值不确定度的主要来源。当面粉中蛋白质的含量为12.51 g/100 g 时，其扩展不确定度为0.016 g/100 g。所以，在测定面粉中蛋白质含量时，应该保证滴定管、移液管和容量瓶等玻璃器皿经过严格鉴定，同时注意提升操作人员的检测技能，严格按照操作步骤进行，提高检测结果的准确性和精密度，使检测结果更加可靠、真实。