直肠癌新辅助放化疗反应的预测性分子标志物研究进展

黄栋 杜金林

根据2014年中国恶性肿瘤发病和死亡分析统计，我国结直肠癌发病率（27.08%）位于第三，死亡率（13.13%）位于第五［1］。直肠癌发病率约占结直肠癌总发病率的1/2，且以中低位直肠癌为主，中晚期直肠癌居多［2］。目前局部进展期直肠癌的标准治疗方案是新辅助放化疗后的根治性手术。

虽然新辅助放化疗可以提高中低位直肠癌的可切除性，但不同患者新辅助放化疗治疗的结果从完全缓解到无肿瘤退行不等，因此，在新辅助放化疗前确定那些对新辅助放化疗治疗不敏感的患者至关重要，而在新辅助治疗之前确定预测性的分子生物标志物，对那些对新辅助放化疗治疗不敏感的患者极为重要。

生物标志物的定义是“作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指标而被客观测量和评估的特征”。理想的生物标志物应具有足够的敏感性、特异性，并与疾病的严重程度相关。关于新辅助放化疗疗效的评估，文献中多以TRG分级系统进行评估，在临床实践中最常见的四种 TRG 分级系统是由 Mandard 等［3］，Dworak等［4］，Wheeler等［5］和Ryan等［6］（表1）提出的。在这篇综述中，我们总结了近年来基于组织和血液的分子生物标志物研究在预测直肠癌新辅助放化疗反应方面的进展。包括研究生物标志物与新辅助放化疗反应以及长期预后（如OS和DFS）之间的关联。

表1 最常用的肿瘤退化分级（tumor regression grade，TRG）系统

1.蛋白质和代谢物

癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是CRC中被广泛认可的预后和疾病监测的生物标志物，CEA与新辅助放化疗疗效的关系已被深入研究。虽然一半以上的研究使用5 ng/mL作为CEA的截断值，但尚未有CEA升高的有效截断值具有足够的敏感性和特异性。有研究将新辅助放化疗前血清CEA浓度≤5.33 ng/mL作为预测直肠癌新辅助放化疗敏感的指标［7］。Song等［8］研究了674例接受新辅助放化疗治疗的局部进展期直肠癌患者的资料，发现新辅助放化疗后CEA水平、新辅助放化疗前后CEA比值与肿瘤降期显著相关。Dudani等［9］的研究发现新辅助放化疗前CEA升高是无病生存期（disease-free survival，DFS），短期总生存期（overall survival，OS）和病理完全缓解（pathologic complete response，pCR）的独立预测因子。

端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶复合物的催化蛋白，利用端粒酶内部RNA模板（TR）合成新端粒序列，延长真核染色体末端的端粒，从而防止细胞衰老和死亡。Rampazzo等［10］的研究表明TERT水平的低表达以及新辅助放化疗前后的TERT水平差异与新辅助放化疗治疗反应相关。

2.循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTCs）

CTCs是一种实时的生物标志物，在预测及筛选对新辅助放化疗治疗敏感或抵抗的患者方面表现出良好的前景［11］。多项研究发现，对新辅助放化疗敏感者在新辅助放化疗后采集的血样中的CTCs相对于不敏感者显著下降［11-13］。

3.宿主免疫反应

近年来，越来越多的证据表明，在肾细胞癌、肝细胞癌、胃癌和食管癌等实体肿瘤中，局部和全身炎症反应与不良预后相关。这种与肿瘤相关的炎症反应可以通过血液学参数反映出来。其中，中性粒细胞与淋巴细胞的比值（NLR）升高的被证明是pCR较差的预测因子［14-15］。也有多项研究表明新辅助放化疗前的高水平白细胞计数与较差的治疗反应相关。Xiao等［16］则发现肿瘤浸润细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）和淋巴细胞比率（lymphocyte ratio，LYMR）是pCR的独立预测因子。

4.血管内生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF在肿瘤放疗的微环境中有重要作用。Yu等［17］测定了31例局部进展中至低位直肠癌患者在接受新辅助放化疗前的肿瘤标本的5个生物标志物（VEGF，PD-L1，DAXX，p-STAT3，EGFR）与新辅助放化疗敏感性的相关性。发现只有VEGF表现为显著的独立预测因子。

5.血小板计数

在临床观察中，我们会发现不同类型的肿瘤中，血小板增高常与不良预后相关。Belluco等［18］将血小板计数300×109/L作为截断值进行研究。发现在接受新辅助放化疗治疗的直肠癌患者中，治疗前高的血小板计数是一个消极的预后因素。但是目前仍然很难定义一个最佳的血小板计数截断值。

6.循环肿瘤基因（ctDNA）

循环肿瘤基因是肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，是一种特征性的肿瘤生物标记，是一种可以准确反映肿瘤负荷的实时监测指标。Zhou等［19］发现ctDNA突变的中位变异等位基因频率（variant allele frequency，VAF）是无转移生存期的强独立预测因子。

7.FOX转录因子家族

FOX蛋白是一类从酵母到人类都广泛存在的转录因子。FOX家族蛋白功能涉及胚胎发育、细胞周期调控、糖类、脂类代谢、生物老化及免疫调节等多种生物学过程，其突变和表达异常与发育畸形代谢性疾病以及肿瘤发生有关［20］。Zhang等［21］通过数据库分析发现FOXK1和FOXK2的过表达与新辅助放化疗后较差的预后相关。

1.DNA突变和DNA甲基化

目前有许多研究人员将基因型生物标志物作为新辅助放化疗pCR的潜在预测因子。一项研究发现对新辅助放化疗反应差的直肠癌相对与有良好反应的直肠癌更容易同时发生KRAS和TP53突变（KP基因型）［22］。Wan等［23］发现8号染色体≥5个拷贝和CTCs中ARID1A，HDAC1，APC，ERBB3，TP53，AMER1，AR的8个非同义突变与pCR相关。

DNA甲基化被认为是参与调控基因表达的重要表观遗传机制，并且基于DNA甲基化的生物标记物被认为是用于癌症诊断和预后的有用工具。Canto等［24］对直肠癌和正常组织样本进行全基因组DNA甲基化分析发现完全病理缓解患者肿瘤中高甲基化探针相对于不完全病理缓解的患者比例较高。

2.MicroRNA

MicroRNA（miRNA）是一种高度保守的小的非编码RNA，长度为18～25个核苷酸，参与基因的表达后调控。Machackova等［25］发现miR-487a-3p与不完全缓解密切相关。Cristóbal等［26］证明mir-199b的表达与新辅助放化疗疗效有关。Du等［27］研究发现miR-548c-5p、miR-548d-5p和miR-663a与新辅助放化疗后的完全缓解显著相关。Campayo等［28］发现miR-21、miR-99b和miR-375组合可预测新辅助放化疗后的完全缓解与否。

3.长链非编码RNA（lncRNA）

lncRNA是长度为＞200个碱基对的RNA，在基因表达、蛋白表达和染色质状态等多种生物学功能中发挥重要作用。Yokoyama等［29］的研究提示lncRNA中的H19和UCA1可能参与了对5-FU的易感性，进而与对新辅助放化疗的敏感性相关。

4.基因表达谱

肿瘤组织的整体基因表达谱有可能识别与新辅助放化疗反应相关的基因信号。虽然研究的基因众多，但目前发现主要与细胞增殖和凋亡［30-35］、肿瘤转移［30-31］、细胞周期［32］、DNA修复［33，36］和细胞分化［36-37］相关（表2）。

表2 基因表达谱对结直肠癌新辅助放化疗敏感性的预测

5.肿瘤免疫微环境

激活宿主免疫应答在放化疗的治疗效果中起着重要作用，同时它也可以激活免疫抑制途径。在肿瘤免疫微环境的影响因素中，CD8+TIL被研究最多，多数研究认为新辅助放化疗前较高的CD8+TIL与较差的病理反应和预后相关［22，38-39］。

6.微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）

MSI是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象，常由错配修复（mismatch repair，MMR）功能缺陷引起，与癌症发生有关，可用于癌症检测。Hasan等［40］的研究发现MSI（+）是一个降低病理完全缓解的独立预测因子。

7.DNA修复基因

基因组完整性的维持对正常细胞增殖和存活是至关重要的。而DNA修复失败将会导致基因组不稳定和癌症。因此DNA修复基因的表达失调很有可能会产生对新辅助放化疗的不良反应。Jimenez等［41］的研究提示DNA修复基因表达差的患者更易产生对新辅助放化疗的不良反应。

SNPs主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。Peng等［42］发现SNP中PTEN：rs12569998与对新辅助放化疗的反应显著相关，PTEN杂合子：rs12569998对新辅助放化疗的反应优于野生型基因型，AKT2：rs8100018与5年无病生存率（DFS）相关。AKT2杂合子：rs8100018患者复发风险降低，5年无病生存率优于野生型基因型患者，但还没有发现有SNP与pCR显著相关［42］。

印戒细胞癌是一种含有大量黏液的癌细胞，黏液把细胞核挤向细胞的一侧，其恶性程度高，预后较差。有研究发现新辅助放化疗前的活检样本中的印戒细胞成分与较好的新辅助放化疗反应显著相关，然而，关于印戒细胞癌对新辅助放化疗疗效的预测价值，目前还缺乏相关数据［43］。

尽管新辅助放化疗在直肠癌中的应用已十余年，但我们目前仍缺乏在治疗前或治疗早期区分对新辅助放化疗耐药患者和敏感患者的能力，从而指导对治疗方案的适应性修改。虽然目前已经提出了许多分子生物标记物作为新辅助放化疗反应的预测指标，然而还没有一个达到临床标准。而在直肠癌中缺乏预测新辅助放化疗的生物标志物可归因于分子生物标志物研究方法上的几个问题。

首先，大多数研究只评估了一种类型的生物标记物，而没有评估它们相对于其他标记物的性能，并且它们自身的敏感性和特异性也不够。因此，有必要比较和整合多种不同的生物标记物（包括临床病理和影像学特征），以对比它们之间的性能，从而开发出一种最佳的、可靠的生物标志物模型，能够更准确地预测对新辅助放化疗的反应的生物标志物模型。

第二，结直肠癌是一种高度异质性的疾病。并且一些研究表明CRC具有较高的肿瘤内异质性［44］。基于这些发现，单一的生物标志物不太可能达到足够的敏感性和特异性来预测不同患者对新辅助放化疗的敏感性，因此研究生物标记物和肿瘤生物学之间的联系机制，增加生物标记物及其潜在局限性的大量信息，对我们能够选择与特定疾病亚型最相关的分子生物标记物极为重要。

第三，使用不同的TRG系统也可能是研究中的潜在偏差。在本文所述的研究中使用了各种TRG系统。包括Mandard等［3］，Dworak等［4］，Wheeler等［5］和Ryan等［6］提出的四种TRG系统。这些临床变异性可能会增加统计分析所需的样本数量，影响得出明确结论。因此，今后的研究应严格设计有足够数量的样本，遵循相同的新辅助放化疗方案和标准化的肿瘤应答评价系统。

总之，尽管没有预测分子生物标志物对新辅助放化疗有足够的临床效用，但是整合不同类型的生物标志物包括临床病理和影像学特性，以及肿瘤生物学的联系机制的认识或许可以开发出一种最佳的、可靠的生物标志物模型，能够更准确地预测对新辅助放化疗的反应。