肿瘤间质成熟度与结直肠癌预后关系的Meta分析

杨伟 陈洁静 吴巍 刘茂安 戴勇 倪庆

肿瘤细胞的生物学行为不仅与自身的基因突变有关，大量研究表明肿瘤微环境也起了重要的作用［1］。肿瘤微环境包括肿瘤细胞所处间质的结构、功能和代谢环境，间质中的肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）通过释放细胞因子与肿瘤细胞存在交互作用，同时通过分泌细胞外基质促进肿瘤细胞的增殖和侵袭［2］。有研究表明肿瘤微环境中细胞外纤维间质的合成以及重塑引起纤维间质反应的程度，即促纤维间质反应（desmoplastic reaction，DR）能够反映细胞外间质的成熟度［3］。DR以HE染色为基础，根据纤维间质形态分为成熟型、中间型和不成熟型。研究表明DR是影响结直肠癌等实体肿瘤预后的独立因素［4］。本研究将已发表的DR与结直肠癌预后的生存资料进行Meta分析，最终明确肿瘤间质成熟度与结直肠癌预后的关系。

一、文献纳入排除标准

1.纳入标准：（1）所有关于结直肠癌肿瘤间质成熟度与预后的临床研究，包含临床病理特征资料以及随访资料；
（2）研究开展的年代和地区清晰；
（3）研究对象为病理学结果证实为结直肠癌的患者；
（4）患者术前未接受过放化疗，（5）同一机构或作者相同年份发表的不同研究对象均入选；
（6）肿瘤间质成熟度按照DR程度分为不成熟型、中间型和成熟型；
（7）预后观察指标中包括5年无复发生存率、5年无病生存率、5年总生存率中的一种；
（8）设计类型为前瞻性或回顾性队列研究。

2.排除标准：（1）重复发表或已发表的综述或Meta分析；
（2）不含对照组或非暴露组的文献；
（3）研究结果不包含结直肠癌原发灶DR程度的文献；
（4）统计学方法不合理；
（5）不包含或无法从生存曲线提取预后风险比（HR）数据的文献。

二、文献检索

以“肿瘤间质成熟度”“促纤维间质反应”“促纤维反应”“间质反应”“间质反应程度”“间质分级”“间质密度”“结直肠癌”“预后”“tumor stroma maturity”“desmoplastic stroma reaction”“desmoplastic reaction”“stroma reaction”“degree of stroma reaction”“stroma classification”“stroma density”“colorectal cancer”“colon cancer”“rectal cancer”“prognosis”为检索词检索万方、中国知网、维普等中文数据库，以及Cochrane Library、PubMed、SpringerLink、EBSCO、MEDLINE等外文数据库，时间从建库开始至2021年1月，包括前瞻性和回顾性队列研究。

三、文献筛选与质量评价

所有的临床数据均由两位评价者独立提取，若有分歧再由第三位加入讨论，一般资料包括作者、发表年份、国家或地区、设计类型、样本量、年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤位置、分化程度、肿瘤间质成熟度、随访时间，同一作者的研究队列按照发表时间顺序排列，主要观察指标包括3年或5年无复发生存率、无病生存率和总生存率。纳入的文献根据NOS量表进行评估。

四、统计学方法

所有数据采用RevMan5.4进行分析，异质性采用I2和Q检验评估文献异质性，若I2＜50%或P＞0.05则异质性不明显，采用固定效应模型；
若I2＞50%或P≤0.05则异质性较大，采用随机效应模型。生存资料采用风险比HR、95%可信区间和P值表示，纳入研究≥10篇时，采用漏斗图分析发表偏倚，若文献＜10篇则不检验，Meta回归采用R语言“metafor”包进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

一、文献检索结果及质量评价

通过检索获得文献104篇，通过阅读标题等排除明显不符的文献9篇，初步纳入文献95篇，通过阅读摘要，排除不相关及非临床研究的文献后共纳入27篇，通过阅读全文，根据纳入和排除标准最终纳入符合条件的文献15篇［5-19］。通过NOS量表评价纳入的前瞻性和回顾性队列研究，评分均为6～8分，属于高质量研究，见图1及表1。

图1 文献检索流程图

表1 纳入研究的基本特征及NOS量表评分（±s，例）

表1 纳入研究的基本特征及NOS量表评分（±s，例）

注：DR（desmoplastic reaction）：促纤维间质反应，OS：总生存，DFS：无病生存，RFS：无复发生存，DSS：疾病特异生存，NA：未提供

Ueno［5］Ueno［6］Ueno［7］Ueno（1）［8］Ueno（2）［8］Ueno［9］Ueno（1）［10］Ueno（2）［10］Shin［11］Konishi［12］Nearchou（1）［13］Nearchou（2）［13］Ueno（1）［14］Ueno（2）［14］Gonzalez［15］Hacking［16］Ao［17］Gonzalez［18］Ueno［19］研究 时间 国家 样本量 分期结局NOS评分2002 2004 2014 2015 2015 2017 2018 2018 2019 2018 2019 2019 2019 2019 2020 2020 2020 2021 2021英国日本日本日本日本日本日本日本韩国美国日本英国日本日本美国美国日本美国日本研究类型队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列队列627 862 412 880 474 821 466 432 151 851 283 163 679 446 342 234 363 372 991性别（男/女）393/234 NA NA 512/368 268/206 484/337 264/202 247/185 88/63 407/444 184/99 87/76 400/279 267/179 179/163 111/118 209/154 189/183 601/390年龄（岁）60.3±12 NA 61.4±12 62.9±13 66.3±13 66.2±12 59.9±13 65.1±12 63.2±11 66±14 62.3±11 63±12 64.0±12 67.0±12 65.2±12.6 64±13 66.6±12 65.7±12.9 65.5Ⅰ～ⅢⅠ～ⅢⅣⅡ～ⅢⅡ～ⅢⅡ～ⅢⅢ ⅢⅠ～ⅣⅠ～ⅢⅡⅡⅡⅡⅠ～ⅢⅠ～ⅢⅢⅠ～ⅢⅡ肿瘤部位（结肠/直肠）NA直肠NA 609/271 382/92 510/311 276/190 251/181 47/104 454/397 92/76/115 65/57/41 458/221 287/159 204/138 105/33/42 203/160 227/145 807/184分化程度（高/中/低）140/402/85 NA 205/190/11 256/574/50 201/232/41 401/365/55 202/231/33 181/216/35 11/130/5 NA 145/25/113 2/93/25 276/368/35 253/171/22 148/104/90 106/68/60 121/212/30 294/56/22 420/526/45 DR（不成熟/中间型/成熟）72/159/396 125/284/453 153/122/137 192/275/413 82/170/222 214/282/325 169/133/164 145/140/147 30/91/60 95/256/500 88/105/90 28/79/56 430/180/69 235/142/69 66/133/143 28/48/152 148/106/109 67/140/165 59/294/638随访时间（月）153（80～267）140 61（11～188）68 68 59（1～86）59（45～144）58（1～87）56 58 NA NA 91 58 NA NA 61（1～136）62（1～170）69.7（2.1～105.6）OS OS OS、DFS DFS、OS DFS、OS RFS、DSS RFS RFS OS RFS OS OS RFS、OS RFS、OS RFS DFS RFS RFS RFS 6 6 6 7 8 7 7 8 7 8 7 8 8 9 6 6 6 6 8

二、纳入文献的基本特征

纳入15篇文献均为外文文献，其中4篇文献分别包含两个不同研究对象的队列，累计纳入19个队列9 849例结直肠癌患者的资料，包括肿瘤间质成熟型4 339例，中间型3 048例，不成熟型2 456例；
其中两项研究包含Ⅳ期患者，其余均为Ⅰ～Ⅲ期。各研究特征资料均包括发表时间、地区、研究类型、样本量、性别、年龄、分期、肿瘤部位、随访时间以及观察指标，各研究的基本特征见表1。

三、Meta分析结果

1.无复发生存率

共有8篇文献10个队列研究了肿瘤间质成熟度与无复发生存率的关系，采用固定效应模型进行Meta分析，结果显示：与成熟型组相比，不成熟组患者无复发生存率明显低于成熟型组患者（HR=2.66，95%CI：2.30～3.08，P＜0.00001），见图2，中间型组患者无复发生存率亦明显低于成熟型组患者（HR=1.36，95%CI：1.17～1.59，P＜0.0001），两组研究均无明显异质性（I2=0，P＞0.05），见图3。

图2 肿瘤间质不成熟组与成熟组患者无复发生存率比较的Meta分析结果

图3 肿瘤间质中间型组与成熟组患者无复发生存率比较的Meta分析结果

2.无病生存率

共有3篇文献4个队列研究了肿瘤间质成熟度与无病生存率的关系，肿瘤分期为Ⅰ～Ⅳ期，Meta分析显示与成熟型组相比，不成熟组患者无病生存率明显低于成熟型组患者（HR=3.68，95%CI：2.33～5.81），各研究间异质性明显（I2=67%），采用随机效应模型分析，见图4，中间型组患者无病生存率亦明显低于成熟型组患者（HR=1.85，95%CI：1.53～2.24，P＜0.0001），各研究未见明显异质性（I2=43%，P＞0.05），采用固定效应模型分析，见图5。

图4 肿瘤间质不成熟组与成熟组患者无病生存率比较的Meta分析结果

图5 肿瘤间质中间型组与成熟组患者无病生存率比较的Meta分析结果

3.总生存率

共有5篇文献8个队列研究了不成熟组患者与成熟组患者总生存率的差异，肿瘤分期为Ⅰ～Ⅳ期，Meta分析显示与成熟型组相比，不成熟组患者总生存率明显低于成熟型组患者（HR=1.70，95%CI：
1.53～1.87，P＜0.00001）， 各 研 究I2=47%（P＞0.05），采用固定效应模型分析，按照是否包含Ⅳ期患者进行亚组分析，结果提示不包含Ⅳ期患者中不成熟组总生存率明显低于成熟型组（HR=1.61，95%CI：1.44～1.80，P＜0.00001），纳入研究I2=47%（P＞0.05），包含Ⅳ期患者中不成熟组总生存率亦明显低于成熟型组（HR=2.04，95%CI：
1.65～2.54，P＜0.00001）， 研 究I2=0（P＞0.05）。中间型组患者未研究总生存率。见图6。

图6 肿瘤间质不成熟组与成熟组患者总生存率比较的Meta分析结果

4.发表偏倚分析

将纳入无复发生存率的10个队列研究进行发表偏倚分析，采用漏斗图检验，漏斗图基本对称，对称性良好，以无复发生存率纳入文献漏斗图为例，10个队列研究基本分布于95%可信区间内，提示无明显的发表偏倚。见图7。

图7 肿瘤间质不成熟组与成熟组患者无复发生存率比较的Meta分析漏斗图

5.Meta回归分析

将年龄、地区、性别、分期、肿瘤部位、分化程度进行回归分析，结果表明：年龄、地区、性别、分期、肿瘤部位、分化程度均不影响无复发生存率和总生存率。见表2。

表2 复发生存率和总生存率的Meta回归分析

目前已有较多关于肿瘤微环境的研究，肿瘤微环境的变化尤其是肿瘤间质的变化与肿瘤的进展密切相关，Beck等［20］在乳腺癌中发现肿瘤间质比肿瘤细胞本身与生存更密切相关。肿瘤微环境或肿瘤间质随着肿瘤的进展处于动态变化的过程，研究表明在肿瘤和间质交界处，胶原纤维的形成及重构尤其是粗大胶原束的形成是肿瘤间质成熟的标志，这一动态纤维化过程称为DR，是肿瘤间质或肿瘤微环境的重要指标［21］。根据肿瘤边缘间质成分是否包含透明样疤痕胶原和黏液样间质，将DR成熟度分为成熟型、中间型和不成熟型［5］。在肿瘤发生早期，纤维间质将肿瘤细胞固定局限，代表着一种肿瘤细胞的宿主反应［21］，但随着肿瘤进展，肿瘤细胞可突破纤维间质的束缚向肿瘤周围浸润性生长。已有研究表明肿瘤边缘纤维间质反应与结直肠癌进展密切相关［22］，一些体外实验表明，如在黑色素瘤中抑制纤维间质反应可能促进肿瘤的转移［23］，但 Coulson-Thomas等［24］研究认为结直肠癌DR能够上调胶原纤维的合成同时限制肿瘤的侵袭，因此，纤维间质反应在肿瘤进展中是一个动态变化的过程，在肿瘤进展的不同阶段发挥着不同的作用。

目前已有较多关于肿瘤间质成熟度与结直肠癌预后关系的研究，本研究从循证医学角度证实了肿瘤间质纤维分化程度越低则预后越差。基于术后病理HE切片的TNM分期是目前结直肠癌预后分期的金标准。然而对于一些Ⅱ期或Ⅲ期的患者，分期虽然一致，但预后却有明显差异，因此，研究和发现更多的预后相关因子对同期患者进行危险因素分层具有重要意义。TNM分期主要关注的是肿瘤细胞本身，但肿瘤周围微环境与肿瘤预后也明显相关［1］，因此，DR着重于肿瘤间质的形态学观察，可作为结直肠癌TNM病理分期的重要补充。

本研究系统和定量分析了肿瘤间质成熟度与结直肠癌预后的关系，Meta分析结果显示，相对于间质成熟型患者，不成熟型和中间型患者无复发生存率、无病生存率、总生存率均明显降低。纳入无复发生存率研究的患者均为Ⅰ～Ⅲ期，异质性分析结果显示无异质性，说明研究结果较稳定。无病生存率Meta分析研究中异质性大可能与纳入研究较少和包含Ⅳ期患者有关，因此后期还需更多针对Ⅳ期患者以及更多关于无病生存率的研究。总生存率Meta分析中纳入两项包含Ⅳ期患者的研究，通过亚组分析表明，在Ⅳ期结直肠癌伴转移患者中，原发灶DR与总生存率亦明显相关。

有研究表明DR与CAFs密切相关，CAFs作为一种重要的肿瘤间质细胞，在调节肿瘤微环境中具有促肿瘤和抗肿瘤两种特性［25］，同时CAFs表型与DR密切相关［11］。肿瘤细胞通过和CAFs的交互作用，重构不成熟纤维间质后有利于肿瘤细胞浸润和转移，同时CAFs通过分泌化学因子和细胞因子促进肿瘤细胞上皮间质转化，而上皮间质转化是一种公认的肿瘤细胞转移方式［26］。同时不成熟纤维间质内含有较多的肿瘤萌芽［27］，而肿瘤萌芽是一种与肿瘤预后较差密切相关的微环境指标。研究表明不成熟间质内是一种“少血管”的状态可导致淋巴细胞浸润困难［8］，最终导致肿瘤细胞能够逃脱免疫反应。因此，DR与肿瘤细胞的交互作用涉及到多种分子机制，仍需要更多较深入的研究。

本研究表明不成熟组患者预后最差，其次是中间型患者，因此，DR分级可以较好地预测结直肠癌患者的预后。有研究表明，DR分级作为微环境因素的预测效能要高于传统的肿瘤相关因素，如肿瘤分化、血管侵犯甚至肿瘤TNM分级，有研究报道DR分级也可用于术前接受过放化疗的结直肠癌患者的预后预测［9］。DR分级提示我们不仅要研究肿瘤的分子生物学功能，同时也要关注肿瘤间质形态学的变化。

本研究也存在一定局限性：（1）纳入Ⅳ期患者的研究相对较少；
（2）研究无病生存率的相关文献较少；
（3）纳入研究主要来自日本和欧美国家，尚缺少针对中国患者的大样本研究；
（4）不同国家和地区、不同手术者的手术水平和手术方式存在差异，以及术后辅助治疗方案的差异可能会对结果造成影响；
（5）DR分级采用半定量的方式，主观判断亦可能对结果有影响。综上，本研究表明肿瘤间质成熟度与结直肠癌的预后密切相关，可作为常规病理切片观察指标的补充，同时需要针对我国结直肠癌患者的多中心前瞻性队列研究来进一步验证。