同一来源不同恶性程度的Hepa1-6肿瘤细胞恶性相关基因表达、增殖能力及肿瘤微环境免疫细胞表型变化比较

徐夕冶 柳迪 唐丽

(1 青岛大学基础医学院，山东 青岛 266071；

2 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所)

恶性肿瘤起源于获得特定遗传改变的单个体细胞，其发生是一个复杂且不断适应的过程[1]，该过程涉及到许多肿瘤细胞本身功能的改变，包括细胞分化状态、端粒维持、细胞增殖控制、营养环境变化适应、血管生成能力、避免细胞死亡等[2]。免疫系统的生理功能之一是在肿瘤形成后对其进行杀伤，在肿瘤细胞和免疫系统博弈的过程中有一部分肿瘤细胞可逃避免疫系统的杀伤，塑造免疫抑制性微环境，获得免疫监视适应，最终产生一些原有肿瘤所不具备的生物学特性，促进肿瘤发生[3-7]。已有研究表明，体内已经产生的肿瘤，在外界药物刺激下可逐渐进化[4]，相较之下，机体自身因素对肿瘤进化的作用尚不十分清楚。本研究诱导相同肿瘤模型但恶性程度不同的肿瘤细胞，通过检测特征基因的表达水平、体外增殖能力以及体内成瘤能力评价肿瘤细胞恶性程度，分析其恶性程度与肿瘤微环境免疫细胞表型的相关性，并首次探究机体自身因素导致的肿瘤细胞恶性化过程中，介导免疫抑制性微环境形成的关键免疫细胞亚群。现将结果报告如下。

1.1 动物来源

6～8周龄C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号为SCXK(京)2021-0006，动物饲养于北京国家蛋白质科学中心动物房SPF级环境中。

1.2 主要试剂

CCK8检测试剂盒购自金普来公司，RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，反转录试剂盒购买于日本TaKaRa公司，荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自日本TOYOBO公司，抗小鼠CD163-PerCP-eFlour710、Foxp3-FITC、IFNγ-PE、CTLA-4-APC、PD-1-APC-eFlour®780、Granzyme B-FITC抗体购买于美国Thermo Fisher公司，抗小鼠Ly6G-PE、CD11b-BUV395、CD3-BV421、NK1.1-BV510、CD4-PE-Cy7抗体购买于美国BD公司，抗小鼠CD16/CD32、F4/80-APC、CD11c-PE-Cy7、Ly6C-FITC、CD45-redFluorTM710抗体及死活染料购买于美国Tonbo公司，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.3 细胞系来源、培养及传代

原始Hepa1-6小鼠肝癌细胞系购自北京协和细胞资源中心。将5×105个原始Hepa1-6细胞种植到C57BL/6小鼠皮下，30 d后流式分选荷瘤小鼠瘤内肿瘤细胞，经体外培养后获得一轮驯化细胞系Hepa1-6-A。将5×105个Hepa1-6-A细胞种植到C57BL/6小鼠皮下，30 d后流式分选荷瘤小鼠瘤内肿瘤细胞，经体外培养后获得二轮驯化细胞系Hepa1-6-B。

将细胞置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的细胞培养箱中用含质量浓度100 g/L FBS的DMEM培养基培养。待细胞汇合度达到90%时，加入胰酶消化。消化2～3 min后显微镜下观察细胞形态，细胞呈圆形时加入等体积含质量浓度100 g/L FBS的DMEM培养基终止消化。混匀成单细胞悬液后转移至离心管，1 000 r/min离心5 min。弃上清液，加入适量含质量浓度100 g/L FBS的DMEM培养基重悬沉淀，按1∶2比例传代培养。培养至对数生长期的细胞用于后续实验。

1.4 采用qPCR法检测3种细胞系当中己糖激酶2(HK2)、碱性螺旋环螺旋转录因子(Twist1)、波形蛋白(VIM)、B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)、细胞周期蛋白B1(CCNB1)及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)mRNA表达

通过QIAGEN RNA提取试剂盒和自动核酸提取仪分别提取3种细胞的RNA，按照反转录试剂盒提供的标准步骤进行反转录反应，获取cDNA，以cDNA作为模板进行qPCR反应。以GPDH为内参分析目的基因表达。引物名称及其序列见表1。

表1 引物名称及其序列Tab.1 Primer names and sequences

1.5 CCK-8法检测3种细胞增殖能力

收集处于对数生长期的细胞，计数后制备细胞悬液(2×108个/L)，接种在96孔板中(0.1 mL/孔)，培养4 h待细胞贴壁后，根据CCK-8试剂盒说明书要求，每孔中加入CCK-8试剂10 μL，继续培养4 h后，以酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值，以吸光度值代表细胞增殖能力。

1.6 小鼠肿瘤模型的建立

取对数生长期的细胞，胰酶消化成单细胞悬液，用DMEM培养基洗涤细胞2次后计数，于每只小鼠右侧胁部皮下注射0.1 mL细胞悬液，细胞数量为1×106或5×105个，按照注入肿瘤细胞的不同对小鼠进行分组，Hepa1-6组8只，Hepa1-6-A组10只，Hepa1-6-B组13只，建模后定期观察各组小鼠的状态。

1.7 肿瘤体积及质量测定

建模当天为第0天，从第4天开始，每隔2天用游标卡尺测量小鼠皮下种植肿瘤的长径(a)及与之垂直的短径(b)，计算肿瘤体积(V)，V=a×b2/2 mm3，测量至第16天，绘制肿瘤生长曲线。建模第16天，小鼠脱颈处死，剖离肿瘤组织，剔除周围脂肪和结缔组织后进行称量，记录肿瘤质量。

1.8 肿瘤组织流式检测样本的制备

将1.7中剖离的肿瘤组织放至1 mL含1 g/L胶原酶和100 g/L FBS的DMEM培养基之中[5]，将肿瘤组织剪碎，并置于37 ℃温箱中进行消化。20 min后吹散组织，吸取少量上清液至培养皿中，置于显微镜下观察消化情况，当镜下出现大量大小不一的细胞时，则加入1 mL含有100 g/L FBS的 DMEM培养基终止消化。吹散组织，滤网过滤，在4 ℃下1 526 r/min离心5 min以后弃上清液，加入适量1×红细胞裂解液裂解红细胞，1 min以后用等体积含100 g/L FBS的DMEM培养基终止红细胞裂解，再经1 526 r/min离心3 min后，用 PBS洗涤细胞2次后，弃上清液进行后续流式抗体标记。

1.9 流式细胞术检测肿瘤组织免疫细胞亚群

用Fc-Shield封闭细胞上的Fc受体，防止后续荧光素偶联抗体与细胞的非特异性结合。细胞与表面标记抗体在4 ℃下孵育30 min，按照说明书标记死活染料，排除死细胞。对于需要进行胞内抗体标记的标志物叉头框蛋白P3(Foxp3)、Ⅱ型干扰素(IFNγ)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)和颗粒酶B(Granzyme B)，先固定破膜后再加入抗体避光孵育30 min，孵育后用固定破膜Buffer洗涤细胞，1 526 r/min离心3 min后加0.2 mL Buffer重悬沉淀并转移至流式上样管。使用BD Fortessa流式细胞仪对1.2中所列流式抗体对应指标进行检测，用FlowJo软件对数据进行分析。

1.10 统计学处理

采用GraphPad Prism 7和SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析(任意两组间比较采用q检验)，两组间比较采用t检验，多组不同时间比较采用重复测量设计的方差分析，两变量之间的关系采用Pearson相关性分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2.1 3组细胞系中各基因表达水平比较

qPCR结果显示,各组间HK2、BCL-2 mRNA表达水平比较差异具有显著性(F=22.557、34.604，P<0.05)，与Hepa1-6细胞相比较，Hepa1-6-A和Hepa1-6-B细胞中以上基因表达水平显著增高(q=6.658～12.327，P<0.05)。此外，各组间的VIM、Twist1、CCNB1和M-CSFmRNA表达水平比较差异具有显著性(F=10.897～195.234，P<0.05)，与Hepa1-6和Hepa1-6-A细胞相比，Hepa1-6-B细胞中以上基因表达水平均呈显著增高(q=4.692～22.190，P<0.05)。见表2。

表2 3组细胞系中各基因表达水平比较Tab.2 Comparison of gene expression levels between the three groups of cells

2.2 3组细胞系增殖能力比较

CCK8检测结果显示，Hepa1-6、Hepa1-6-A和Hepa1-6-B细胞吸光度值分别为1.13±0.08、1.18±0.11、3.43±0.21，组间比较差异具有显著意义(F=645.459，P<0.05)，与Hepa1-6、Hepa1-6-A细胞相比，Hepa1-6-B细胞体外增殖能力更强(q=37.585、40.357，P<0.05)，Hepa1-6和Hepa1-6-A细胞的增殖能力比较差异无显著性(P>0.05)。

2.3 3组细胞系构建小鼠肿瘤模型后肿瘤生长情况比较

以小剂量肿瘤细胞(5×105)构建Hepa1-6肿瘤模型后，小鼠第6天荷瘤率为0，以大剂量肿瘤细胞(1×106)构建Hepa1-6肿瘤模型后，小鼠第6天荷瘤率可达90%，而小剂量肿瘤细胞(5×105)构建小鼠Hepa1-6-A、Hepa1-6-B肿瘤模型，小鼠第6天荷瘤率即达100%。重复测量设计方差分析结果显示，时间、组别及时间与组别交互作用对肿瘤体积具有明显影响(F时间=26.977，F组别=127.599，F交互=4.613，P<0.05)，Hepa1-6-B组肿瘤生长从第6天起明显快于Hepa1-6-A组(F=8.033～43.418，P<0.05)。见表3。Hepa1-6、Hepa1-6-A和Hepa1-6-B组第16天肿瘤质量分别为(0.29±0.12)、(0.36±0.20)、(0.72±0.19)g，组间肿瘤质量比较差异具有显著性(F=18.898，P<0.05)，Hepa1-6-B组肿瘤质量明显高于Hepa1-6和Hepa1-6-A组(q=6.379、8.099，P<0.05)。

表3 不同时间点3组细胞系皮下种植肿瘤体积比较Tab.3 Comparison of the volume of subcutaneously implanted tumor between the three groups of cells at different time points

2.4 3组细胞系皮下种植肿瘤浸润髓系细胞差异比较

流式细胞术检测结果显示，与Hepa1-6-A组肿瘤相比，Hepa1-6-B组肿瘤组织中性粒细胞和树突状细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)，单核细胞比例明显降低(t=4.032,P<0.05)，巨噬细胞比例明显升高(t=2.929,P<0.05)，发挥促肿瘤功能的M2型CD163+巨噬细胞和CD206+巨噬细胞比例明显升高(t=2.619、2.870,P<0.05)，详见表4；
Pearson相关性分析显示，CD163+巨噬细胞与CD206+巨噬细胞比例和肿瘤体积呈正相关(r=0.669、0.736，P<0.05)。

表4 3组细胞系皮下种植肿瘤浸润髓系细胞比例比较Tab.4 Comparison of the percentage of tumor-infiltrating myeloid cells in subcutaneously implanted tumor between the three groups of cells

2.5 3组细胞系皮下种植肿瘤浸润淋巴细胞差异比较

流式细胞术检测结果表明，与Hepa1-6-A组相比，Hepa1-6-B组肿瘤组织中CD8+T细胞功能性标志物IFNγ、Granzyme B的表达水平均显著降低(t=2.358、3.076,P<0.05)，Treg细胞比例比较差异无显著性(P>0.05)，但IFNγ+CD8+T/Treg明显降低(t=2.430,P<0.05)。Hepa1-6-B组肿瘤组织中CD8+T细胞抑制性标志物CTLA-4表达水平与Hepa1-6-A组比较差异无显著性(P>0.05)，但程序性死亡受体1(PD-1)表达水平呈显著升高(t=3.693,P<0.05)。见表5。无论是Hepa1-6-A组肿瘤还是Hepa1-6-B组肿瘤，PD-1+CD8+T细胞比例与肿瘤体积均无明确相关性(P>0.05)。

表5 3组细胞系皮下种植肿瘤浸润淋巴细胞比例比较Tab.5 Comparison of the percentage of tumor-infiltrating lymphocytes in subcutaneously implanted tumor between the three groups of cells

机体的免疫系统可以对肿瘤细胞发挥监视作用，并对其进行特异性清除，然而当肿瘤细胞在各种因素的作用下逃脱机体免疫系统的监视时，肿瘤的恶性化会进一步加快，从而促进肿瘤的增殖、侵袭和转移[6,8]。目前关于机体自身因素介导的肿瘤恶性化与免疫抑制性形成的相关性报道尚少，同时，肿瘤细胞恶性化过程中发挥关键作用的免疫细胞亚群也未见相关研究。

本研究通过构建小鼠肿瘤模型诱导肿瘤细胞发生恶性化，原始Hepa1-6肿瘤细胞经一轮体内建模获得Hepa1-6-A细胞系，Hepa1-6-A细胞系经二轮建模获得Hepa1-6-B细胞系。糖酵解关键酶HK2的表达与活性可影响肿瘤细胞糖酵解，进而影响肿瘤细胞增殖[9-10]。BCL-2可抑制细胞凋亡，其过度表达可以增强肿瘤细胞对大多数细胞毒素的抵抗性[11-12]。本研究的结果显示，与Hepa1-6细胞相比较，Hepa1-6-A和Hepa1-6-B细胞中HK2、BCL-2 mRNA表达水平均显著增高，提示体内成瘤提升肿瘤细胞的生存能力。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，Twist1通过调节间质叉头蛋白1促进EMT的发生[13-14]，VIM表达上调并通过改变细胞形状和运动促成EMT[15]；
CCNB1是在有丝分裂过程中起调控作用的周期蛋白[16]，并且在原发性肝癌组织中表达上调，其mRNA表达水平是影响肝癌患者总生存期和无病生存期的独立危险因素[17]。本研究表明，与Hepa1-6和Hepa1-6-A细胞相比，Hepa1-6-B细胞中VIM、Twist1、CCNB1 mRNA表达水平显著增高。同时，Hepa1-6-B细胞体外增殖能力与体内成瘤速度均显著高于Hepa1-6及Hepa1-6-A细胞。以上数据表明，经体内二次成瘤后，Hepa1-6-B细胞的恶性程度显著增强。上述体内成瘤介导的肿瘤恶性化反映了相同来源的肿瘤细胞在体内由低恶性转变为高恶性的自然变化过程，因此利用该模型有可能从机体自身角度探讨肿瘤细胞恶性化的机制。

肿瘤微环境中免疫细胞的表型和功能与肿瘤恶性程度直接相关。单核细胞可从脉管系统外渗到原发肿瘤部位，通过细胞因子介导的细胞死亡和吞噬作用直接杀死肿瘤细胞从而发挥抗肿瘤作用[7]。微环境因素同时促使单核细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，继而形成抗肿瘤型TAM以及促肿瘤型TAM[18]，后者通常以CD163或者CD206作为标志物[19-21]。本研究结果显示，Hepa1-6-B组肿瘤组织中单核细胞比例明显降低，巨噬细胞特别是促肿瘤型CD163+巨噬细胞和CD206+巨噬细胞比例显著增高。更为重要的是，在Hepa1-6-B细胞肿瘤模型中，CD163+巨噬细胞和CD206+巨噬细胞比例与肿瘤体积呈正相关，但在Hepa1-6-A细胞肿瘤模型中，两者却无明确相关性。此外，本研究结果显示，与Hepa1-6和Hepa1-6-A细胞相比，Hepa1-6-B细胞中促进巨噬细胞存活及分化的M-CSFmRNA表达水平显著升高[22]，初步提示肿瘤细胞与巨噬细胞形成的细胞间动态相互作用环路可能是影响肿瘤恶性程度的重要因素。

肿瘤抗原经抗原提呈细胞呈递后，T细胞成为肿瘤杀伤功能的主要执行者[23-25]。本研究结果表明，Hepa1-6-B肿瘤组织中细胞毒性IFNγ+CD8+T细胞、Granzyme B+CD8+T细胞比例以及IFNγ+CD8+T/Treg均显著降低，说明肿瘤恶性进展中CD8+T细胞逐步丧失活性。PD-1作为免疫检查点与其配体结合后抑制CD8+T细胞增殖、活化和细胞毒性因子的分泌，促进T细胞耗竭[26-27]，其表达水平是微环境免疫抑制性的重要评价指标[28-30]。本研究结果显示，与Hepa1-6-A组肿瘤组织相比，Hepa1-6-B组肿瘤组织中CD8+T细胞高表达PD-1，但无论是Hepa1-6-A组肿瘤还是Hepa1-6-B组肿瘤，PD-1+CD8+T细胞比例与肿瘤体积均无明确相关性。PD-1表达的增高可能是肿瘤恶性进展的结果而不是原因，但促肿瘤型CD163+巨噬细胞和CD206+巨噬细胞可能是机体自身因素导致肿瘤恶性化的原因之一。

综上所述，本研究结果显示，经二次体内成瘤后，Hepa1-6-B肿瘤细胞恶性相关基因表达水平显著增高，体外增殖能力与体内成瘤速度明显提升，体现出机体自身因素导致的肿瘤恶性化过程，在肿瘤恶性化的同时可增强肿瘤微环境的免疫抑制性，其中促肿瘤型CD163+巨噬细胞和CD206+巨噬细胞与免疫抑制性的形成存在显著相关性。后续还需对体内成瘤介导的肿瘤恶性化的原因及其调控促肿瘤型CD163+巨噬细胞和CD206+巨噬细胞的具体机制进行更深入探究。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest：
All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过国家蛋白质科学中心动物伦理委员会的批准(文件号IACUC202002-27-05M)。所有动物饲养和实验过程均严格按照3R原则进行。

EthicsApprovalandAnimalRight：
All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by National Center for Protein Sciences·Beijing (Approval Letter No. IACUC-20200227-05M), and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of 3R.

作者贡献：徐夕冶、柳迪参与了研究设计；
徐夕冶、柳迪和唐丽参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions：
The study was designed byXUXiyeandLIUDi. The manuscript was drafted and revised byXUXiye,LIUDi, andTANGLi. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.