基于矿质元素的我国不同产地葡萄酒的判别分析

李彩虹，开建荣，闫玥，葛谦，王芳，张静，杨春霞，王彩艳

(宁夏农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏 银川，750002)

葡萄酒的商业价值主要来源于产地[1]，葡萄酒产区是葡萄酒的根和魂，葡萄酒的核心竞争力是葡萄酒产区竞争力。宁夏贺兰山东麓位于中部干旱区，属于典型的大陆性气候，光热资源丰富，日照时间长，昼夜温差大，拥有酿酒葡萄生长得天独厚的气候条件。因此，宁夏贺兰山东麓葡萄酒香气浓郁、纯正，口感圆润、协调。2011年底，在法国举办的中法葡萄酒盲品比赛中，前4名被贺兰山东麓产区葡萄酒包揽。随着人们生活水平的不断提高，葡萄酒销量逐年增加，有些不法商贩为了牟取利益，通过伪造地理标签的方式误导消费者，以劣质农产品代替特色农产品，从而损害了消费者的利益，给品牌竞争带来信任危机[2]。为了规范葡萄酒市场，加强地理标志产品管理，亟需开展葡萄酒产地追溯技术研究，从源头上对其质量进行控制[3-4]。

农产品产地溯源主要是通过分析表征不同地域来源农产品特征性指标，并以此特征指标来实现农产品产地溯源。目前主要采用质谱、光谱、分子生物学技术等，通过分析农产品的同位素含量与比率、矿质元素含量、有机组成、挥发性成分等特征成分，结合化学计量学，建立能够区分农产品产地来源的特征性指纹图谱，从而对不同产地的农产品进行产地溯源[5]。矿质元素溯源技术是根据不同地区农作物含有的矿物质元素含量的差异来实现农产品产地溯源的一种技术，由于受土壤类型和社会发展等环境因素的影响，不同地域土壤中矿物质元素的含量有其独特性和差异性，加之电感耦合等离子体质谱法具有高灵敏度和分析速度快等优点，矿质元素技术已被广泛应用于农产品产地溯源[6-7]，如：枸杞[8]、贝类[9]、新疆红枣[10]、茶叶[11-12]等，取得了理想的效果。

本研究以我国不同产地赤霞珠单品葡萄酒为研究对象，采用微波消解-电感耦合等离子体质谱技术，分析葡萄酒中Ag、Al、As、Ba、Be、Bi等58种矿质元素，研究矿质元素在葡萄酒产地判别中的可行性。研究成果可为葡萄酒产地溯源提供科学方法和理论依据。

1.1 材料与试剂

不同产地赤霞珠单品葡萄酒样本：宁夏贺兰山东麓产区(n=14，7个酒庄)、河北沙城产区(n=18，5个酒庄)、山西清徐产区(n=13，5个酒庄)、甘肃武威产区(n=9，4个酒庄)、渤海湾产区(n=12，7个酒庄)和云南高原产区(n=6，2个酒庄)，共计72个样本。样本采集时间为2020年。宁夏贺兰山东麓不同品种葡萄酒样本：霞多丽(n=9)、美乐(n=9)、蛇龙珠(n=6)、马瑟兰(n=11)、赤霞珠(n=9)和黑比诺(n=10)，共计54个样本。

标准溶液为4组57种元素混合标液，分别为Au、Hf、Ir、Pd、Pt、Ru、Sb、Sn，B、Ge、Mo、Nb、P、Re、Ta、Ti、W、Zr，Ag、Al、As、Ba、Be、Bi、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Rb、Se、Sr、Tl、U、Zn，Ce、Er、Eu、Gd、Ho、Nd、Pr、Sc、Sm、Tb、Th、Tm、Y、Yb；
美国Perkin Elmer公司；
Hg单元素标液，中国计量科学研究院；
质控物为生物成分分析标准物质胡萝卜GBW 10047，中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所；
硝酸(优级纯)，德国Merck公司；
水为实验室一级用水。

1.2 仪器与设备

ELAN DRC-e型电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)，美国 Perkin Elmer 公司；
Mars 6 Xpress微波消解仪，美国CEM公司；
赶酸仪(24位)，莱伯泰科公司；
AL 104 型电子天平，梅特勒-托利多。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

准确吸取5.00 mL葡萄酒样品于微波消解管中，置于赶酸仪上加热至120 ℃挥发乙醇约3 h，冷却后加入硝酸10 mL，常温静置3～4 h或过夜，然后置于微波消解仪中消解，消解程序见表1。消解完成完全冷却后，取掉微波消解管盖子，置于赶酸仪上120 ℃挥发硝酸，约2～3 h取下冷却至室温，用水完全转移至25.0 mL刻度管中，定容。同时做质控品和试剂空白试验。

表1 葡萄酒微波消解条件Table 1 Microwave digestion conditions of wine

1.3.2 ICP-MS工作条件

电感耦合等离子体质谱仪测定元素采用标准模式。优化后的工作条件为：发生器功率：1 300 W；
检测器模拟阶电压：-2 350 V；
离子透镜电压：6.00 V；
雾化器流量：0.98 L/min；
等离子炬冷却气流量：17.0 L/min；
辅助器流量：1.20 L/min。上机测定葡萄酒样品及质控品中58种元素。

1.3.3 方法学验证

各元素标准曲线相关系数均大于0.99，检出限为 0.000 1 μg/L～3.66 mg/L。GBW 10047的各元素测定结果均在标准参考值范围内。各元素测定的标准曲线、检出限和定量限见表2。

1.4 数据处理

每个葡萄酒样本平行2次测定，平行测定结果的相对相差小于10%的平均值作为最后结果进行数据处理。采用SPSS 25.0软件，单因素方差分析方法分析葡萄酒中58种矿质元素在不同产区间的差异性；
主成分分析用降维的方法在58种矿质元素信息中提取了14个综合变量，而这14个综合变量尽可能多地反映58种矿质元素的信息；
Fisher判别分析则是建立了基于矿质元素不同产地、品种葡萄酒的判别模型。

2.1 不同产地葡萄酒中矿质元素含量差异性分析

由表3可知，葡萄酒中58种矿物质元素均有检出，且含量差异较大。大于100 mg/L的有Mg元素，含量介于10～100 mg/L的有P元素，Al、B、Ca、Mn、Rb、Na、Fe、Sr、Ga元素含量介于1～10 mg/L，其次为Ba、Ti、Cu、Zn元素，含量小于1 mg/L，其余元素含量均处于μg/L级。

通过对河北沙城、宁夏贺兰山东麓、山西清徐、甘肃武威、渤海湾和云南高原6个葡萄酒产区的赤霞珠单品葡萄酒中58种元素含量进行方差分析，结果显示，Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cs、Cu、Eu、Hg、Li、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、Rb、Sc、Se、Sr、Th、Tl、Yb、Fe、Zn、P、Ru、Au、Ta、Hf、Pd、Zr和Re 35种元素含量在6个产区存在显著差异(P<0.05)，Ce、Cr、Er、Gd、Ge、Ho、Nb、Nd、Pr、Sb、Sm、Sn、Tb、Ti、Tm、U、Y、Zr、Pt、W、Ga、Ca和Ag 23种元素含量在不同产区差异不显著(P>0.05)(表3)。宁夏贺兰山东麓葡萄酒中 As、B、Ru、Ta和Pt 5种元素含量显著高于其他产地，而Cd、Cs、Mn、Rb、Zn、Pd 和 Zr 7种元素含量显著低于其他产地；
云南高原产区葡萄酒中Cs含量显著高于其他产区，但是Al、As、B、Bi、Co、Er、Mg、Na、Ni、Pr、Sc、Tm、Th、Yb、Fe、Hf、Ga和Ca 18种元素含量显著低于其他产区；
渤海湾产区葡萄酒中Al、Ba、Be、Cd、Co、Cs、Eu、Mg、Mn、Na、Ni、Rb、Sc、Sm、Tl、Yb、Zn、Ga和Re 19种元素含量显著高于其他产区，相比之下，Hg、Ru和Au含量相对较低；
武威产区Li、Sr、Fe、Hf、Pd和Zr 6种元素含量相对高于其他产区。由此可见，不同产区葡萄酒中矿质元素含量具有较大的差异性。

表2 ICP-MS仪器测定矿物元素标准曲线、检出限和定量限Table 2 Standard curve, detection limit and quantification limit of mineral elements determined by ICP-MS

表3 不同产区葡萄酒矿物元素含量差异性Table 3 Differences of mineral element content in wines from different producing areas

2.2 不同产地葡萄酒中矿质元素含量主成分分析

主成分分析技术是重要的指纹分析技术之一，它将多项指标重新组合成一组新的互相无关的几个综合指标，能够用较少指标反应较多信息的一种无监督分析方法[13-18]。对不同产地葡萄酒进行主成分分析，降低维度，使变量之间关系更加清晰。经过最大方差法旋转，各因子的载荷值更接近于0或1，能够更好区分主成分下的因子，旋转后的主成分分析结果见附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20220321006)。根据特征值>1的原则，提取了14个主成分，累计方差贡献率达到了85.351%，基本综合了原始数据的信息。

由表4可知，第1主成分的方差贡献率为26.562%，综合了Al、Ce、Er、Eu、Gd、Ho、Nd、Pr、Sm、Tb、Tm、Y、Yb、W、Re的信息；
第2主成分的方差贡献率为10.552%，综合了Ba、Cd、Co、Rb、Sc、Zn、Ga的信息；
第3主成分的方差贡献率为9.405%，综合了Mg、Mn、Nb、Se、Ru的信息；
第4主成分的方差贡献率为7.807%，综合了As、B、Li、Sr、Pt的信息；
第5主成分的方差贡献率为7.312%，综合了Hg、Mo、P、Ca的信息；
第6主成分的方差贡献率为4.849%，综合了Th、Au、Ir的信息；
第7主成分的方差贡献率为3.502%，综合了Hf、Pd、Zr的信息；
第8主成分的方差贡献率为2.685%，综合了Cu、Ni、Tl的信息；
第9主成分的方差贡献率为2.540%，综合了Cr、Fe的信息；
第10主成分的方差贡献率为2.483%，综合了Sn的信息；
第11主成分的方差贡献率为2.177%，主要包含了Ti的信息；
第12主成分的方差贡献率为2.06%，主要包含了Ag的信息；
第13主成分的方差贡献率为1.82%，主要包含了Na的信息；
第14主成分的方差贡献率为1.597%，主要包含了Sb的信息。筛选出Al、Ce、Er、Eu、Gd、Ho、Nd、Pr、Sm、Tb、Tm、Y、Yb、W、Re、Ba、Cd、Co、Rb、Sc、Zn、Ga、Mg、Mn、Nb、Se、Ru、As、B、Li、Sr、Pt、Hg、Mo、P、Ca、Th、Au、Ir、Hf、Pd、Zr、Cu、Ni、Tl、Cr、Fe、Sn、Ti、Ag、Na和Sb 52种葡萄酒的特征矿物元素。

表4 前14个主成分的载荷矩阵及方差贡献率Table 4 Load matrix and variance contribution rate of the first 14 principal components

2.3 基于矿质元素葡萄酒产地区分模型的建立

为了进一步考察各元素含量对葡萄酒原产地判别的影响，建立基于Fisher判别函数的一般判别方法对葡萄酒产地进行多变量判别，以58种元素作为自变量，进行逐步判别分析。结果显示，Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Ce、Co、Cr、Cs、Cu、Er、Eu、Gd、Ge、Hg、Ho、Li、Mg、Mn、Mo、Na、Nb、Rb、Zn和Ta共计27种对产地判别显著的元素被引入到判别模型中，建立了不同产地葡萄酒的判别方程，分别为:

Y(河北沙城产区)=2.069Al-1.638As-0.330B+129.498Ba-5.665Be+71.060Bi-65.635Cd-17.643Ce-4.772Co+0.944Cr-0.066Cs-0.001Cu+505.791Er+138.429Eu+1 716.408Gd+449.052Ge+392.595Hg-537.235Ho-0.121Li+0.062Mg+2.430Mn+10.333Mo+0.224 Na+21.641Nb+20.871Rb+6.314Zn+165.893Ta-74.784；

Y(宁夏贺兰山东麓产区)=2.068Al-1.799As+5.750B+474.154Ba-53.651Be-117.304Bi-136.610Cd-22.460Ce-4.527Co+1.670Cr-0.082Cs-0.013Cu+454.295Er+477.257Eu+1366.916Gd-6.763Ge-182.974Hg-960.057Ho+0.235Li-0.052Mg+3.246Mn+3.913Mo+0.193Na+34.970 Nb-0.129Rb-0.442Zn+432.901Ta-71.945；

Y(山西清徐产区)=781Al-7.837As+0.070B+181.257Ba-5.479Be+204.068Bi-27.684Cd-39.570Ce-1.591Co+1.079Cr-0.063Cs+0.024Cu+663.664Er-223.755Eu+2 107.862Gd+329.224Ge+131.305Hg-2 127.883Ho-0.028Li+0.107Mg-0.437Mn+8.031Mo+0.247 Na+27.501 Nb+20.519Rb-9.047Zn+137.123Ta-71.718；

Y(甘肃武威产区)=3.646Al-4.955As+0.205B+421.421Ba-13.312Be-0.913Bi-110.024Cd-33.518Ce-0.731Co+1.322Cr-0.057Cs+0.008Cu+880.708Er+3.019Eu+1744.523Gd+39.949Ge-13.380Hg-1 313.931Ho+0.248Li+0.022Mg+0.878Mn+5.892Mo+0.232 Na+30.708 Nb+6.600Rb+3.925Zn+219.156Ta-58.894；

Y(山东渤海湾产区)= 5.495Al-11.588As-4.512B+232.126Ba+7.102Be+223.109Bi-33.465Cd-61.045Ce-2.317Co+0.648Cr-0.125Cs+0.028Cu+1 290.999Er-346.698Eu+2 916.345Gd+458.431Ge+348.028Hg-3 055.169Ho-0.018Li+0.180Mg-1.070Mn+16.199Mo+0.546 Na+32.038 Nb+39.949Rb+9.867Zn+39.747Ta-145.413；

Y(云南高原产区)= 2.915Al-5.233As-1.191B+226.983Ba-13.816Be-32.491Bi-32.896Cd-24.464Ce-4.944Co+0.959Cr+0.014Cs+0.009Cu+639.290Er-100.879Eu+1 688.460Gd+281.635Ge+180.329Hg-921.914Ho-0.021Li+0.041Mg+1.612Mn+9.047Mo+0.149 Na+24.926Nb+10.161Rb+17.239Zn+177.853Ta-50.358。

2.4 基于矿质元素的不同产地葡萄酒的判别分析

单因素方差分析揭示了不同产地葡萄酒矿质元素含量的差异性，但不能对不同产地葡萄酒进行准确判别，本研究采用Fisher判别分析法对不同产区葡萄酒进行判别。以58种特征元素作为自变量，不同产地作为分类变量，利用Fisher线性判别分析对6个产区葡萄酒样品进行产地鉴别(图1、表5)。研究表明，通过27个元素指标，可以将6个不同产地的葡萄酒判别出来，回代检验正确判别率为98.6%，交叉验证的正确判别率为84.7%，回代检验是针对所有训练样本进行的检验，样品的错判率是相应总体率的偏低估计，而交叉检验比较真实地体现了模型的判别能力[19]。其中沙城产区77.8%的样品被正确识别，贺兰山东麓产区100%的样品被正确识别，清徐产区84.6%的样品被正确识别，武威产区88.9%的样品被正确识别，渤海湾产区83.3%的样品被正确识别，云南高原产区66.7%的样品被正确识别。由此可以看出，基于矿质元素技术，宁夏贺兰山东麓赤霞珠葡萄酒可以很好地被判别，云南高原产区判别率低，可能是因为云南样本量少，不能全面代表该产区葡萄酒信息的原因。

图1 不同产地葡萄酒在分类平面上的散点图Fig.1 The scatter plot of wines from different regions on a classification plane

表5 不同产区葡萄酒的一般判别分析结果Table 5 Results of general discriminant analysis of wines from different appellation areas

2.5 宁夏贺兰山东麓不同品种葡萄酒的判别分析

为了验证葡萄酒的品种是否对产地判别产生影响，试验采用Fisher判别分析法对宁夏贺兰山东麓产区6个单品葡萄酒进行品种判别。以58种矿物元素作为判别分析的自变量，进行逐步判别分析。结果显示，Al、As、B、Ba 等40种对品种判别显著的元素被引入到判别模型中[2]。分类结果表明，回代检验的整体正确判别率分别为100%，交叉检验整体正确判别率仅为38.9%(表6)，每个品种均有大部分样本被误判，以上分析说明基于矿物元素指纹的差异不能有效鉴别不同品种的葡萄酒。

通过分析宁夏贺兰山东麓、河北沙城、山西清徐、甘肃武威、渤海湾和云南高原6个我国葡萄酒主产区

表6 不同品种酿酒葡萄葡萄酒的一般判别分析结果Table 6 Results of general discriminant analysis of different varieties of wine grape wine

72个赤霞珠单品葡萄酒中的58种矿质元素含量及组成特征，明确了Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cs、Cu、Eu、Hg、Li、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、Rb、Sc、Se、Sr、Th、Tl、Yb、Fe、Zn、P、Ru、Au、Ta、Hf、Pd、Zr 和 Re 35种元素含量在6个产区间存在显著差异(P<0.05)。通过主成分分析提取出14个主成分，综合了58种矿质元素85.351%的总信息。Fisher判别分析确定了Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Ce、Co、Cr、Cs、Cu、Er、Eu、Gd、Ge、Hg、Ho、Li、Mg、Mn、Mo、Na、Nb、Rb、Zn、Ta 27种葡萄酒产地识别的有效溯源元素指标，构建了不同产地葡萄酒判别模型，该模型基本能鉴别不同产地的葡萄酒。而基于矿物元素的差异不能有效鉴别不同品种的葡萄酒。本研究显示，矿质元素技术是葡萄酒产地溯源行之有效的方法。目前，稳定同位素也是农产品产地溯源的有效手段，后续工作中，继续挖掘矿质元素技术结合稳定同位素技术，采用多元统计方法进行葡萄酒产地溯源，形成更准确更高效的鉴别技术，为鉴别地理标志产区葡萄酒的真实性提供理论依据和技术手段。