TFPI-2在膀胱癌组织中的表达及临床意义

刘锦裕，谢锦来，谢建兵

(福建省莆田学院附属医院 泌尿外科，福建 莆田 351100)

膀胱癌是我国泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，男性发病率位于全身恶性肿瘤第7位[1]。据统计2002年世界男性膀胱癌标准化死亡率约4/10万，女性约1.3/10万，男性约为女性的3～4倍[2]。膀胱癌已严重威胁人类的健康。组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)是一种 Kunitz 型蛋白酶抑制剂，在人类心、肝、肾等正常组织中广泛表达[3]。研究发现TFPI-2可降低多种肿瘤的侵袭转移能力，如乳腺癌[4]、肺癌[5]、甲状腺癌[6]、胶质母细胞瘤[7]等。至于TFPI-2是否可降低膀胱癌的侵袭转移能力有待进一步研究。本研究旨在探讨TFPI-2与膀胱癌发生、发展的关系，并探讨其可能机制，现报告如下。

1.1 一般资料

收集2011年7月-2014年7月在莆田学院附属医院泌尿外科确诊为膀胱癌并进行手术的患者共60例，男性45例，女性15例，年龄38～75岁，中位年龄(55.3±6.5)岁。其中非肌层浸润性膀胱癌39例，浸润性膀胱癌21例，标本均取癌组织及癌旁正常组织各1份(术后病理证实)。所取标本均放在-80 °C冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

EliVision plus试剂盒、TFPI-2、血管内皮生长因子单克隆抗体(Vascular endothelical growth factor monodonal antibody，VEGF MCAb)、Real time PCR Master Mix(SYBR Green)、引物合成由某公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化

取非肌层浸润性膀胱癌组织、浸润性膀胱癌组织和癌旁正常组织进行常规石蜡切片(连续切片3张)，免疫组化按福州EliVision plus免疫组化试剂盒说明书进行。结果判定标准详见参考文献[8]。

1.3.2 Realtime PCR

用Trizol法提取非肌层浸润性膀胱癌组织、浸润性膀胱癌和癌旁正常组织总RNA，总cDNA的合成和PCR扩增参照试剂盒说明书进行。引物：TFPI-2上游引物CAGGAGCCAACAGACTACGG，下游引物AAATTGTTGGCGTTGCCCTC；
VEGF上游引物CTGTCTAATGCCCTGGAGCC，下游引物ACGCGAGTCTGTGTTTTTGC；
GAPDH上游引物AGATCATCAGCAATGCCTCCT，下游引物TGAGTCCTTCCACGATACCAA。扩增产物长度：TFPI-2：119 bp；
VEGF：124 bp；
GAPDH：90 bp。反应条件：95℃预变性5 min；
95℃变性15 s；
60℃退火20 s(TFPI-2、VFGF、GAPDH)，72℃延伸40s；
扩增35个循环。样品和内参均设3个重复组。结果分析：从仪器中读出TFPI-2、VEGF及GAPDH在以上3组中的循环阈值(cycle threshold，ct值)，ΔΔct=实验组Δct-对照组△ct，组织含量大小主要是根据2-ΔΔct大小判定，2-ΔΔct值越大，组织含TFPI-2 mRNA、VEGF mRNA含量越高。2-ΔΔct值>1为目的基因表达上调；
<1为目的基因表达下调。

1.3.3 统计学方法

2.1 TFPI-2蛋白在癌旁正常组织、非肌层浸润性膀胱癌组织、浸润性膀胱癌组织中的表达情况

免疫组化显示TFPI-2主要表达部位在细胞质，呈棕黄色。在癌旁正常组织中TFPI-2高表达，在膀胱癌组中呈低表达或不表达。60例癌旁正常组织中，TFPI-2 蛋白表达阳性者48例，阳性率达80%。60例膀胱癌组织中，TFPI-2 蛋白表达阳性者20例，阳性率为33.33%，2组差异具有统计学意义(P<0.01)。其中39例非肌层浸润性膀胱癌组织中，阳性有16例，阳性率41.03%。21例浸润性膀胱癌组织中，阳性只有4例，阳性率19.05%，2组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1A、图1B、图1C。

VEGF主要表达部位在细胞质或细胞膜，呈棕黄色。在正常膀胱组织中几乎不表达，在膀胱癌组中呈高表达，尤其是在浸润性膀胱癌组织。60例癌旁正常组织中，VEGF全部不表达。60例膀胱癌组织中，VEGF蛋白表达阳性者50例，阳性率为83.33%，2组差异具有统计学意义(P<0.01)。其中39例非肌层浸润性膀胱癌组织中，阳性有31例，阳性率79.49%。21例浸润性膀胱癌组织中，阳性有19例，阳性率90.48%，2组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1D、图1E、图1F。

2.2 TFPI-2mRNA、VEGF mRNA在癌旁正常组织、非肌层浸润性膀胱癌组织、浸润性膀胱癌组织中的表达情况。

浸润性膀胱癌组和非肌层浸润性膀胱癌组中得TFPI-2mRNA的表达均明显低于癌旁组，而 VEGF mRNA的表达则均明显高于癌旁组(癌旁组VEGF mRNA几乎不表达)，差异具有统计学意义(P<0.01)；
浸润性膀胱癌组中，TFPI-2mRNA的表达低于非肌层浸润性膀胱癌组，而VEGF mRNA的表达则高于非肌层浸润性膀胱癌组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 TFPI-2mRNA和VEGF mRNA在不同膀胱组织中的表达比较

膀胱肿瘤是我国泌尿外科最常见的恶性肿瘤之一，是一种直接威胁患者生存的疾病。手术成为膀胱肿瘤主要治疗手段，还有放疗、化疗、介入等治疗手段。尽管膀胱癌治疗手段多种多样，但仍不能改变膀胱癌复发率高的特性，尤其是浸润性膀胱癌，容易出现复发、转移。故目前除了研究手术、放疗、化疗方案等，如何降低膀胱肿瘤术后及放化疗后的复发、转移也成为研究热点之一。

TFPI-2是一种丝氨酸蛋白酶抑制物，它可抑制多种蛋白酶的活性，从而抑制肿瘤的侵袭和转移[9]。研究发现它还可通过抑制新生血管的生成，从而抑制肿瘤增殖、浸润、转移[10、11]。本研究发现TFPI-2在癌旁正常组织中高表达，在膀胱癌组中呈低表达或不表达，且恶性程度越高，TFPI-2表达越低。这说明了TFPI-2可能与膀胱癌的发生、发展密切相关。

恶性肿瘤的发生、发展与血管的生成密切相关，血管生成可为肿瘤提供养分并为其去除代谢废物，是肿瘤生长的必要条件[12、13]。VEGF是一种血管内皮分裂素，可通过促进血管内皮细胞分裂增殖从而促进血管生成；
也可通过增加血管通透性，导致血浆成分外渗，从而引起肿瘤转移[14]。由此可见VEGF与肿瘤发生、发展密切相关。本研究发现VEGF在正常癌旁组织中几乎不表达，在膀胱癌组中呈高表达，尤其是在浸润性膀胱癌组织中，提示VEGF可能与膀胱癌发生、发展密切相关。

本研究应用免疫组化和realtime PCR检测TFPI-2和VEGF在膀胱癌中的表达情况，结果发现TPFI-2在膀胱癌的表达明显低于癌旁正常组织，且浸润性膀胱癌的表达低于非肌层浸润性膀胱癌，差异有统计学意义。而VEGF的表达刚好相反，VEGF在正常癌旁组织中几乎不表达，在膀胱癌组中呈高表达，且浸润性膀胱癌的表达高于非肌层浸润性膀胱癌，差异有统计学意义。该结果提示TFPI-2的低表达和VEGF高表达与膀胱癌的发生、发展密切相关。TFPI-2可能通过抑制VEGF的表达，从而抑制膀胱癌的发生、发展。

综上所述，TFPI-2和VEGF与膀胱癌发生、发展密切相关，有望成为判断膀胱肿瘤生物学行为及预后的重要指标。后期可通过TFPI-2基因转染，甚至动物模型的建立，来进一步研究膀胱癌的发生、浸润、转移机制，可为膀胱癌的基因治疗提供新的靶向和治疗方案。